Preventie van chronische longziekten (CLD - Preventieonderzoek)

Achtergrond Chronische longziekte (CLD) is een van de meest voorkomende complicaties van perinatale longbeschadiging en vertegenwoordigt een systemische aandoening met gevolgen op de lange termijn, zoals aanhoudende longdisfunctie, astma-achtige symptomen en BPCO. CLD erkent veel prenatale risicofactoren, waaronder roken door de moeder, chorioamnionitis en intra-uteriene groeivertraging (IUGR), naast postnatale risicofactoren zoals hyperoxie, parenterale voeding, ontsteking en mechanische ventilatie. Blootstelling aan ontstekingen in de baarmoeder verandert de ontwikkeling van het neonatale immuunsysteem en maakt de foetale long vatbaar voor een ontregelde, langdurige reactie op invasieve mechanische ventilatie en suprafysiologische zuurstof. Reacties op schadelijke (en beschermende) invloeden op jonge leeftijd worden gemoduleerd door genetische en epigenetische mechanismen, die kunnen resulteren in permanente structurele veranderingen met aanzienlijke gevolgen op volwassen leeftijd. IUGR-zwangerschappen worden gekenmerkt door verhoogde oxidatieve stress en IUGR-zuigelingen lopen een hoog risico op hart- en vaatziekten, metabool syndroom, longdisfunctie en chronische nier- en ademhalingsziekten op volwassen leeftijd. Ondanks de voortdurende toename van de kennis van de mechanismen die leiden tot de progressie van longschade, Tot nu toe is er nog geen effectief management ontwikkeld dat zou leiden tot preventie van CLD.

Doelstellingen

1. prospectief potentiële biomarkers identificeren die het ernstige beloop van de longfunctie in de eerste twaalf levensmaanden kunnen voorspellen en een nieuw profiel realiseren om pasgeborenen met een hoog risico vroegtijdig te identificeren.
2. detecteer het genetische variantie-oorzaakmodel (door het MiSeq Illumina-platform) dat correleert met ernstige longdisfunctie en de ontwikkeling van astma.
3. detecteren zowel microRNA's als anti- en pro-inflammatoire cytokinevariaties (MIP-1a, MCP-1, IL-8, TNF-a, IFN-g, IL-10) die correleren met de ernst van longdisfunctie in de eerste 12 maanden van het leven en het risico op de ontwikkeling van astma.

Experimenteel ontwerp Dit is een multicenter longitudinaal onderzoek, waarvan het primaire doel het identificeren van een nieuw risicovol neonatale profiel voor de ontwikkeling van chronische longziekte (CLD) is, beginnend bij het perinatale leven. Om dit doel te bereiken zullen alle deelnemende eenheden een vaginaal uitstrijkje uitvoeren bij de ingeschreven moeders, placenta- en navelstrengbloed verzamelen bij de geboorte en perifeer bloed, bronchoalveolaire lavagevloeistof (BALF), meconium en ontlastingsmonsters van alle ingeschreven pasgeboren baby's. Het onderzoek begint met de evaluatie van prenatale risicofactoren.

Na de bevalling worden de placenta’s gefixeerd in 10% gebufferde formaline. Vervolgens zullen macroscopische en microscopische analyses worden uitgevoerd volgens de consensusverklaring van de Amsterdamse placenta workshopgroep. Bij alle ingeschreven vrouwen wordt bij de bevalling een vaginaal uitstrijkje afgenomen. Drie ml navelstrengbloed (slagader en/of ader) zal worden afgenomen voor analyse van miRNA, genetische variantie en cytokines. Alleen bij geïntubeerde zuigelingen wordt een BALF-monster verkregen door 1 ml/kg natriumchloride 0,9% in de endotracheale tube te druppelen en de vloeistof in een steriele slijmvanger te zuigen. Het eerste BALF-monster zal binnen de eerste 24 uur van het leven worden verzameld, terwijl verdere BALF-monsters na 7 en 28 levensdagen zullen worden verzameld bij pasgeborenen die nog steeds geïntubeerd zijn. Het eerste meconiummonster na de geboorte en aanvullende ontlastingsmonsters worden verzameld op 7, 28 levensdagen, 6 en 12 levensmaanden. Vaginale uitstrijkjes, placenta-, BALF-, meconium- en ontlastingsmonsters worden bij -80°C bewaard tot verdere verwerking. Voor elk monster wordt bacteriële DNA-extractie uitgevoerd in een strikt gecontroleerde biologische veiligheidswerkplaats van niveau 2 met behulp van DANAGENE MICROBIOME DNA-kits (Danagen-Bioted) volgens de instructies van de fabrikant.

In navelstrengserum bij de geboorte (slagader) en na 48 levensuren zullen 8-10 kandidaat-miRNA's, in het bijzonder miR-451, miR-29b en miR-16, worden bestudeerd omdat is aangetoond dat ze een remmend effect hebben op angiogenese door onderdrukking van vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) en miR is geassocieerd met genetische gevoeligheid voor CLD. Het genetische variantie-oorzaakmodel zal worden uitgevoerd bij alle ingeschreven pasgeborenen na 48 levensuren (minstens 500 μl volbloed) met behulp van een MiSeq Illumina-platform dat de toepassing van Next Generation Sequencing-technologieën mogelijk maakt.

Om anti- en pro-inflammatoire cytokinevariaties te detecteren die correleren met de ernst van de ziekte in de loop van de tijd, zullen navelstrengbloed- en perifere bloedmonsters (2 ml in een EDTA-buisje) worden verkregen van de opgenomen baby's bij de opname (binnen 48 levensuren). , op 7 en 28 levensdagen, op 6 en 12 maanden. Zowel anti- (INF-y) als pro-inflammatoire (IL-6 en NGF) cytokineniveaus zullen onderzocht worden. Alle monsters worden tot het testen bij -80 °C bewaard. Cytokinen zullen worden gemeten met een in de handel verkrijgbare ELISA-kit volgens de instructies van de fabrikant.

De onderzoekers zullen ook proberen de associatie tussen moeder- en placentagegevens te onderzoeken met analyses van pasgeborenen tijdens de eerste levensdagen. Bij opname van pasgeborenen op de neonatale intensive care zal aanzienlijke aandacht worden besteed aan het vaststellen van de mate en variaties in de hemo-oxygenatie, evenals aan de aanwezigheid van een infectie die aan de oorsprong ligt van oxidatieve stress (OS) en OS-gerelateerde ziekten. De volgende monsters worden afgenomen: 1 ml perifeer bloed (binnen 48 levensuren). Er zullen aanvullende perifere bloedmonsters worden afgenomen op de leeftijd van 7 en 28 dagen, en op de leeftijd van 6 en 12 maanden.

Oxidatieve stress (OS) en lipidenmediatoren die betrokken zijn bij OS zullen worden geëvalueerd door zowel biomarkers van oxidatieve eiwitschade (Advanced Oxidation Protein Products, AOPP) als lipidenperoxidatie (Isoprostanes, IsoPs). Een verdere evaluatie van het oxidatieve stressprofiel zal worden uitgevoerd door het meten van niet-enzymatische antioxidantmoleculen (vitamine E; glutathion, GSH en ascorbinezuur, AA) en enzymatische antioxidantmoleculen (superoxide-dismutase, SOD, catalase, CAT en glutathionperoxidase, GPx). ). Hiertoe zal gebruik worden gemaakt van hoogwaardige vloeistofchromatografie (HPLC) en gaschromatografie-gekoppelde massaspectrometrie (GC-MS): HPLC om vitamine E, glutathion, GSH en AA te detecteren.

De laatste stap zal bestaan ​​uit het prospectief identificeren van een nieuw profiel van pasgeborenen met een hoog risico op ernstige longdisfunctie in de eerste twaalf maanden van hun leven, met een hoger risico op het ontwikkelen van astma en COPD op latere leeftijd. Een langetermijnresultaat van alle ingeschreven baby's zal worden uitgevoerd om de relaties tussen placenta-analyse, miRNA-expressie, ontsteking en microbiota te ontrafelen - als onderdeel van het in utero exposoom (chorioamnionitis of foetale groeivertraging) en oxidatieve stress met ontstekingen - als onderdeel van postnatale factoren (invasieve ademhalingsondersteuning, Patent Ductus Arteriosus, longontsteking, sepsis) - met de longuitkomst in termen van abnormale longfunctie op de leeftijd van 6 en 12 maanden.

Op de leeftijd van 6 en 12 maanden zullen de baby's een klinische en longevaluatie ondergaan. Bij alle ingeschreven baby's zal een longfunctietest (PFT) worden uitgevoerd en deze omvat een getijdenademhalingsanalyse en een stikstofuitspoelingstest. De baby's worden in rugligging geplaatst, tijdens een rustige, natuurlijke slaap, volgens de aanbevelingen van de American Thoracic Society/European Respiratory Society, met meting van longvolumes, flow, functionele restcapaciteit, Lung Clearence Index 5% (LCI 5), Lung Clearence Index 2,5% (LCI 2,5), verhouding tussen tijd tot piekgetijdenuitademingsstroom/uitademingstijd (tPTEF/tE). Om longafwijkingen uit te sluiten, wordt een longecho uitgevoerd. Nadat aanpassing aan het masker is toegestaan, worden getijdenademhaling en stroomvolumelussen gedurende >2 minuten of >20 artefactvrije ademhalingen geregistreerd. Er zal een PFT worden gemaakt om de functionele ademhalingsgegevens te relateren aan die van het gegenereerde biochemische profiel. Alle mogelijke relaties tussen de longfunctie, biochemische markers vlak voor de geboorte en bij zuigelingen op de leeftijd van 6-12 maanden, en antropometrische metingen zullen worden bestudeerd. De ontwikkeling en functie van de longen tijdens het extra-uteriene leven zullen in verband worden gebracht met prenatale metingen. Gegevens die geschikt zijn voor zuigelingen tijdens de zwangerschapsduur (AGA), klein voor zuigelingen tijdens de zwangerschapsduur (SGA) en groot voor zuigelingen tijdens de zwangerschapsduur (LGA) zullen worden vergeleken.

Methoden voor gegevensverzameling Er zullen verschillende soorten gegevens worden verzameld, waaronder kwantitatieve en kwalitatieve gegevens, gegenereerd op basis van beeldvorming, weefsel- en bloedmonsters. Klinische gegevens voor Doel 1, 2 en 3 zullen worden verzameld en beheerd met behulp van REDCap elektronische gegevensverzamelingstools gehost bij UO1-Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli-IRCCS (https://redcap-irccs.policlinicogemelli.it/).

Er zal een speciaal elektronisch casusrapportformulier (eCRF) worden ontwikkeld. Van de betrokken eenheden zullen pseudo-geanonimiseerde gegevens worden verzameld. De onderzoeker is ervoor verantwoordelijk dat het eCRF correct en volledig wordt ingevuld. Bronnen van klinische informatie zijn onder meer het patiëntendossier van de arts, ziekenhuisaantekeningen, originele laboratoriumgegevens, apotheekgegevens, resultaten van echografisch onderzoek enz.

Statistisch plan Het primaire eindpunt van het onderzoek is het identificeren of klinische, demografische, laboratorium- en andere parameters in staat zijn de ontwikkeling van chronische longziekte na 36 weken PMA en/of van een abnormale longfunctie op de leeftijd van 12 maanden te voorspellen. Uitgaande van een acceptabel nauwkeurigheidsniveau, met een Area Under the ROC Curve van ten minste 0,75 ± 0,15, is een steekproefomvang van 42 patiënten vereist.

Statistische analyse Het monster zal worden beschreven in zijn klinische en demografische kenmerken met behulp van de juiste beschrijvende statistische indices. In de diepte zullen kwalitatieve gegevens worden uitgedrukt als absolute en relatieve procentuele frequentie, terwijl kwantitatieve variabelen als gemiddelde en standaarddeviatie (SD) of mediaan en interkwartielbereik (IQR), afhankelijk van het geval. Om de Gaussiaanse verdeling van kwantitatieve variabelen te verifiëren zal de Shapiro-Wilk-test worden toegepast. Verschillen tussen groepen bij aanvang zullen, met betrekking tot kwalitatieve gegevens, worden geëvalueerd door middel van de Chi-Squared-test of de Fisher-Freeman-Haltons-exacte test, afhankelijk van het geval. Kwantitatieve gegevens zullen in plaats daarvan worden vergeleken met behulp van de Student's t-test voor onafhankelijke steekproeven of de niet-parametrische U-test van Mann Withney, afhankelijk van de gegevensverdeling. Vioolplots zullen worden gebruikt om significante of klinisch relevante verschillen grafisch weer te geven. De evaluatie van het verschil in termen van primaire uitkomst na 12 maanden zal worden geëvalueerd door middel van Kaplan-Meier-overlevingsanalyse. In het bijzonder zal de log-rank-test worden toegepast en zullen passende cumulatieve incidentiecurven worden getekend. Om potentiële voorspellers van de primaire uitkomst na 12 maanden te beoordelen, zullen uni- en multivariabele Cox-regressiemodellen worden toegepast. De potentiële voorspellers van de uitkomst zullen diepgaand worden geëvalueerd door middel van gewone Cox-regressiemodellen met proportionele risico's, en vervolgens zullen de Hazard Ratio's (HR) en de 95% betrouwbaarheidsintervallen (CI's) worden gerapporteerd. De evenredigheid van de gevarenfuncties zal worden geëvalueerd door visuele inspectie van de gevaren en de restplots van Schoenfeld. In geval van twijfelachtige proportionaliteit zullen Cox-gewogen regressiemodellen worden toegepast. Voorspellers die in het multivariabele model moeten worden opgenomen, zullen worden geselecteerd op basis van de univariabele analyse (p<0,05 of suggestief, d.w.z. 0,05 p<0,10) en de mening van deskundigen, consistent met de regel van ten minste 10 gebeurtenissen per uitkomstvariabele, en TRIPOD-aanbevelingen. De prestaties van het model zullen worden geëvalueerd door verschillende indices, zoals Cindex, Somers Dxy-rank correlatie, Nagelkerke's R2-waarde, kalibratie-intercept en slop. De C-index kan worden geïnterpreteerd als een AUC, d.w.z. een maatstaf voor de nauwkeurigheid van het model. Statistische significantie wordt vastgesteld voor waarden van p<0,05. Suggestieve p-waarden (0,05, p < 0,10) zullen ook worden gerapporteerd. Statistische analyses zullen worden uitgevoerd met behulp van STATA (StataCorp, VS) en R (https://www.r-project.org/).