慢性肺病的预防（CLD - 预防研究）

背景慢性肺病（CLD）是围产期肺损伤最常见的并发症之一，是一种具有长期后遗症的全身性疾病，例如持续性肺功能障碍、哮喘样症状和BPCO。 CLD 识别许多产前危险因素，包括母亲吸烟、绒毛膜羊膜炎和宫内生长受限 (IUGR)，此外还有高氧、肠外营养、炎症和机械通​​气等产后危险因素。 子宫内暴露于炎症会改变新生儿的免疫发育，并使胎儿肺容易对有创机械通气和超生理性氧气产生长期失调的反应。 生命早期对有害（和保护性）影响的反应受到遗传和表观遗传机制的调节，这可能导致永久性的结构变化，并在成年后产生重大后果。 IUGR妊娠的特点是氧化应激增加，IUGR婴儿成年后患心血管疾病、代谢综合征、肺功能障碍以及慢性肾脏和呼吸系统疾病的风险很高。尽管人们对导致肺损伤进展的机制的了解不断增加，但迄今为止，尚未制定出有效的管理措施来预防慢性肺病。

目标

1. 前瞻性地识别能够预测生命前 12 个月内肺功能严重程度的潜在生物标志物，并实现早期识别高危新生儿的新特征。
2. 检测与严重肺功能障碍和哮喘发展相关的遗传方差因果模型（通过 MiSeq Illumina 平台）。
3. 检测与前 12 个月内肺功能障碍严重程度相关的 MicroRNA 以及抗炎和促炎细胞因子变异（MIP-1a、MCP-1、IL-8、TNF-a、IFN-g、IL-10）生命和哮喘发展的风险。

实验设计 这是一项多中心纵向研究，其主要目的是从围产期开始确定慢性肺病 (CLD) 发展的新高危新生儿特征。 为了实现这一目标，所有参与单位将对登记的母亲进行阴道拭子，收集出生时的胎盘和脐带血以及所有登记的新生儿的外周血、支气管肺泡灌洗液（BALF）、胎便和粪便样本。 该研究将从评估产前危险因素开始。

分娩后，胎盘将固定在 10% 福尔马林缓冲液中。 随后将根据阿姆斯特丹胎盘研讨会小组共识声明进行宏观和微观分析。 所有登记的妇女在分娩时都会采集阴道拭子。 将采集 3 毫升脐带血（动脉和/或静脉）用于分析 miRNA、遗传变异和细胞因子。 仅对于插管婴儿，通过将 1 ml/kg 的 0.9% 氯化钠滴入气管插管并将液体吸入无菌粘液收集器中来获取 BALF 样本。 第一份 BALF 样本将在出生后 24 小时内采集，而更多 BALF 样本将在仍插管的新生儿出生后 7 天和 28 天时采集。 出生后第一份胎便样本以及出生后 7、28 天、6 和 12 个月时采集的额外粪便样本。 阴道拭子、胎盘、BALF、胎便和粪便样本将储存在 -80°C 下直至进一步处理。 对于每个样品，将根据制造商的说明，使用 DANAGENE MICROBIOME DNA 试剂盒 (Danagen-Bioted) 在严格控制的 2 级生物安全工作场所中进行细菌 DNA 提取。

在出生时（动脉）和出生后 48 小时的脐带血清中，将研究 8-10 个候选 miRNA，特别是 miR-451、miR-29b 和 miR-16，因为它们已被证明对通过血管内皮生长因子 (VEGF) 抑制和 miR 实现的血管生成与 CLD 的遗传易感性相关。 将使用允许应用下一代测序技术的 MiSeq Illumina 平台在所有入组新生儿出生后 48 小时（至少 500 μL 全血）中进行遗传方差因果模型。

为了检测随时间推移与疾病严重程度相关的抗炎和促炎细胞因子变化，将从入院时（出生后 48 小时内）的婴儿采集脐带血和外周血样本（2 ml 放入 EDTA 管中） ，在出生后第 7 天和第 28 天、第 6 个月和第 12 个月时。 将研究抗（INF-y）和促炎（IL-6 和 NGF）细胞因子水平。 所有样品在测试前都将储存在-80°C 下。 将根据制造商的说明使用市售的 ELISA 试剂盒测量细胞因子。

研究人员还将尝试探索母亲和胎盘数据与新生儿出生后第一天的分析之间的关联。 新生儿进入新生儿重症监护病房后，将高度重视确定血氧的程度和变化，以及氧化应激 (OS) 和 OS 相关疾病起源的感染的存在。 将采集以下标本： 1 ml 外周血（生后 48 小时内）。 将在出生后 7 天和 28 天、6 个月和 12 个月时收集额外的外周血样本。

氧化应激（OS）和参与 OS 的脂质介质将通过氧化蛋白损伤（高级氧化蛋白产品，AOPP）和脂质过氧化（异前列烷，IsoPs）的生物标志物进行评估。 通过测量非酶抗氧化分子（维生素 E、谷胱甘肽、GSH 和抗坏血酸，AA）和酶抗氧化分子（超氧化物歧化酶、SOD、过氧化氢酶、CAT 和谷胱甘肽过氧化物酶、GPx）对氧化应激谱进行进一步评估。 ）。 为此，将采用高效液相色谱 (HPLC) 和气相色谱接口质谱 (GC-MS)：HPLC 检测维生素 E、谷胱甘肽、GSH 和 AA。

最后一步将前瞻性地确定出生后 12 个月内患有严重肺功能障碍的高风险新生儿的新概况，以及在以后的年龄中患哮喘和慢性阻塞性肺病的风险更高。 将对所有入组婴儿进行长期结果分析，以揭示胎盘分析、miRNA 表达、炎症和微生物群（作为子宫内暴露组（绒毛膜羊膜炎或胎儿生长受限）的一部分）和氧化应激与炎症之间的关系（作为产后的一部分）因素（侵入性呼吸支持、动脉导管未闭、肺炎、脓毒症）——与 6 个月和 12 个月龄肺功能异常有关的肺部结果。

在 6 个月和 12 个月大时，婴儿将接受临床和肺部评估。 将对所有入组婴儿进行肺功能测试（PFT），包括潮式呼吸分析和氮气冲洗测试。 根据美国胸科学会/欧洲呼吸学会的建议，婴儿将处于仰卧位，在安静、自然的睡眠中测量肺容量、流量、功能残气量、肺清除指数 5% (LCI 5)、肺清除率指数 2.5% (LCI 2.5)，潮气呼气流量峰值时间/呼气时间比 (tPTEF/tE)。 将进行肺部超声检查以排除肺部异常。 适应面罩后，将记录 >2 分钟的潮式呼吸、流量循环或 >20 次无伪影呼吸。 进行 PFT 是为了将功能性呼吸数据与生成的生化特征数据联系起来。 将研究肺功能、出生前和 6-12 个月大婴儿的生化标记物以及人体测量值之间任何可能的关系。 宫外生命期间的肺部发育和功能将与产前测量相关。 将比较适合胎龄（AGA）婴儿、小于胎龄（SGA）婴儿和大于胎龄（LGA）婴儿的数据。

数据收集方法 将收集多种类型的数据，包括定量、定性、从成像、组织和血液样本生成的数据。 目标 1、2 和 3 的临床数据将使用 UO1- Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli-IRCCS (https://redcap-irccs.polilinicogemelli.it/) 托管的 REDCap 电子数据采集工具进行收集和管理。

将开发专用的电子病例报告表（eCRF）。 将从相关单位收集伪匿名数据。 研究者将负责确保正确且完整地填写 eCRF。 临床信息的来源包括医生的病历、医院病历、原始实验室记录、药房记录、超声检查结果等。

统计计划 该研究的主要终点是确定临床、人口统计、实验室和其他参数是否能够预测 PMA 36 周时慢性肺病的发展和/或 12 月龄时肺功能异常的发展。 假设准确度水平可接受，ROC 曲线下面积至少为 0.75 ± 0.15，则需要 42 名患者的样本量。

统计分析 将使用适当的描述性统计指数来描述样本的临床和人口特征。 从深度上讲，定性数据将表示为绝对和相对百分比频率，而定量变量则根据情况表示为平均值和标准差 (SD) 或中位数和四分位距 (IQR)。 为了验证定量变量的高斯分布，将应用夏皮罗-威尔克检验。 根据定性数据，将酌情通过卡方检验或 Fisher-Freeman-Haltons 精确检验来评估基线时各组之间的差异。 定量数据将使用独立样本的 Student t 检验或 Mann Withney 的非参数 U 检验进行比较，具体取决于数据分布。 小提琴图将用于以图形方式表示显着或临床相关的差异。 12 个月时主要结局差异的评估将通过 Kaplan-Meier 生存分析进行评估。 特别是，将应用对数秩检验，并绘制适当的累积发生率曲线。 为了评估 12 个月时主要结局的潜在预测因素，将拟合单变量和多变量 Cox 回归模型。 深入地讲，结果的潜在预测因素将通过普通比例风险 Cox 回归模型进行评估，并随后报告风险比 (HR) 和 95% 置信区间 (CI)。 危险函数的比例将通过目视检查危险和舍恩菲尔德残差图来评估。 如果比例可疑，将拟合 Cox 加权回归模型。 将根据单变量分析（p<0.05 或暗示性，即 0.05 p<0.10）和专家意见选择包含在多变量模型中的预测变量，与结果变量至少 10 个事件的规则和 TRIPOD 建议一致。 模型的性能将通过几个指标来评估，例如Cindex、Somers Dxy-rank相关性、Nagelkerke's R2值、校准截距和斜率。 C 指数可以解释为 AUC，即模型准确性的度量。 p<0.05 的值设定为统计显着性。 还将报告建议的 p 值（0.05，p < 0.10）。 将使用 STATA（StataCorp，美国）和 R (https://www.r-project.org/) 进行统计分析。