Prevention of Chronic Lung Disease (CLD - Prevention Study)

Bakgrund Kronisk lungsjukdom (CLD) är en av de vanligaste komplikationerna av perinatal lungskada som representerar ett systemiskt tillstånd med långvariga följdsjukdomar, såsom ihållande lungdysfunktion, astmaliknande symtom och BPCO. CLD känner igen många prenatala riskfaktorer, inklusive moderns rökning, chorioamnionit och intrauterin tillväxtrestriktion (IUGR), förutom postnatala riskfaktorer som hyperoxi, parenteral nutrition, inflammation och mekanisk ventilation. Exponering för inflammation i livmodern förändrar neonatal immunutveckling och predisponerar fostrets lunga för en oreglerad långvarig respons på invasiv mekanisk ventilation och suprafysiologiskt syre. Svar på skadliga (och skyddande) influenser tidigt i livet moduleras av genetiska och epigenetiska mekanismer, som kan resultera i permanenta strukturella förändringar med betydande konsekvenser i vuxen ålder. IUGR-graviditeter kännetecknas av ökad oxidativ stress och IUGR-spädbarn löper hög risk för hjärt-kärlsjukdom, metabolt syndrom, lungdysfunktion och kroniska njur- och luftvägssjukdomar i vuxen ålder. Trots den ständigt ökade kunskapen om de mekanismer som leder till lungskador hittills har ingen effektiv hantering utvecklats som skulle leda till förebyggande av CLD.

Mål

1. prospektivt identifiera potentiella biomarkörer som kan förutsäga det allvarliga förloppet av lungfunktion under de första 12 månaderna av livet och realisera en ny profil för att tidigt identifiera nyfödda med hög risk.
2. upptäcka orsaksmodell för genetisk varians (av MiSeq Illumina-plattformen) som korrelerar med allvarlig lungdysfunktion och utveckling av astma.
3. upptäcka mikroRNA såväl som anti- och pro-inflammatoriska cytokinvariationer (MIP-1a, MCP-1, IL-8, TNF-a, IFN-g, IL-10) som korrelerar med svårighetsgraden av lungdysfunktion under de första 12 månaderna livet och risken för astmautveckling.

Experimentell design Detta är en multicenter longitudinell studie, vars primära syfte är att identifiera en ny högrisk neonatal profil för utveckling av kronisk lungsjukdom (CLD), med utgångspunkt från perinatalt liv. För att nå detta mål kommer alla deltagande enheter att utföra vaginal pinnprover till de inskrivna mödrarna, samla in placenta- och navelsträngsblod vid födseln och perifert blod, bronkoalveolär sköljvätska (BALF), mekonium och avföring från alla inskrivna nyfödda spädbarn. Studien kommer att börja med utvärdering av prenatala riskfaktorer.

Efter förlossningen fixeras moderkakan i 10 % buffrat formalin. Därefter kommer makroskopiska och mikroskopiska analyser att utföras enligt konsensusutlåtandet från Amsterdams placentaverkstadsgrupp. En vaginal pinne kommer att samlas in vid tidpunkten för förlossningen för alla inskrivna kvinnor. Tre ml navelsträngsblod (artär och/eller ven) kommer att utföras för analys av miRNA, genetisk varians och cytokiner. Endast hos intuberade spädbarn kommer BALF-provet att erhållas genom att tillsätta 1 ml/kg 0,9 % natriumklorid i endotrakealtuben och suga in vätskan i en steril slemfälla. Det första BALF-provet kommer att samlas in inom de första 24 timmarna av livet, medan ytterligare BALF-prover kommer att samlas in vid 7 och 28 dagar av livet hos nyfödda som fortfarande kommer att vara intuberade. Första mekoniumprovet efter födseln och ytterligare avföringsprover kommer att samlas in vid 7, 28 levnadsdagar, 6 och 12 levnadsmånader. Vaginala pinnprover, placenta, BALF, mekonium och avföringsprov kommer att förvaras vid -80°C tills vidare bearbetning. För varje prov kommer bakteriell DNA-extraktion att utföras på en strikt kontrollerad nivå 2 biologisk säkerhetsarbetsplats med DANAGENE MICROBIOME DNA-kit (Danagen-Bioted) enligt tillverkarens instruktioner.

I navelsträngsserum vid födseln (artären) och vid 48 timmar av livet kommer 8-10 kandidatmiRNA, särskilt miR-451, miR-29b och miR-16 att studeras då det har visat sig att de har en hämmande effekt på angiogenes genom vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF) suppression och miR är associerad med genetisk känslighet för CLD. Den genetiska variansens orsaksmodell kommer att utföras i alla inskrivna nyfödda efter 48 timmars liv (minst 500 μL helblod) med hjälp av en MiSeq Illumina-plattform som tillåter tillämpning av nästa generations sekvenseringsteknik.

För att upptäcka anti- och pro-inflammatoriska cytokinvariationer som korrelerar med sjukdomens svårighetsgrad över tid, kommer prover från navelsträngsblod och perifert blod (2 ml i ett EDTA-rör) att tas från de inkluderade spädbarnen vid intagningen (inom 48 timmar efter livet) , vid 7 och 28 dagar i livet, vid 6 och 12 månader. Både anti- (INF-y) och pro-inflammatoriska (IL-6 och NGF) cytokinnivåer kommer att undersökas. Alla prover kommer att förvaras vid -80 °C fram till testning. Cytokiner kommer att mätas med ett kommersiellt tillgängligt ELISA-kit enligt tillverkarens instruktioner.

Utredarna kommer också att försöka utforska sambandet mellan moder- och moderkakadata med nyfödda analyser under de första dagarna av livet. Vid inläggning av nyfödda på neonatal intensivvårdsavdelning kommer stor uppmärksamhet att ägnas åt att fastställa graden och variationerna i hemo-oxygenation, samt förekomsten av infektion som är orsaken till Oxidativ Stress (OS) och OS-relaterade sjukdomar. Följande prover kommer att tas: 1 ml perifert blod (inom 48 timmar efter livet). Ytterligare perifera blodprover kommer att samlas in vid 7 och 28 dagar av livet, vid 6 och 12 månader av livet.

Oxidativ stress (OS) och lipidmediatorer involverade i OS kommer att utvärderas både av biomarkörer för oxidativ proteinskada (Advanced Oxidation Protein Products, AOPP) och lipidperoxidation (Isoprostanes, IsoPs). En ytterligare utvärdering av oxidativ stressprofil kommer att utföras genom att mäta icke-enzymatiska antioxidantmolekyler (vitamin E; glutation, GSH och askorbinsyra, AA) och enzymatiska antioxidantmolekyler (superoxiddismutas, SOD, katalas, CAT och glutationperoxidas, GPx ). För detta ändamål kommer högpresterande vätskekromatografi (HPLC) och gaskromatografi-gränssnittsmasspektrometri (GC-MS) att användas: HPLC för att detektera vitamin E, glutation, GSH och AA.

Det sista steget kommer att vara att prospektivt identifiera en ny profil av nyfödda med hög risk för allvarlig lungdysfunktion under de första 12 månaderna av livet, med högre risk att utveckla astma och KOL i senare ålder. Ett långsiktigt resultat av alla inskrivna spädbarn kommer att utföras för att reda ut sambanden mellan placentaanalys, miRNA-uttryck, inflammation och mikrobiota - som en del av in utero-exposomen (chorioamnionit eller fostertillväxtrestriktion) och oxidativ stress med inflammation - som en del av postnatal faktorer (invasivt andningsstöd, Patent Ductus Arteriosus, lunginflammation, sepsis) - med lungutfallet i form av onormal lungfunktion vid 6 och 12 månaders ålder.

Vid 6 och 12 månaders ålder kommer spädbarnen att få klinisk och pulmonell utvärdering. Lungfunktionstest (PFT) kommer att utföras på alla inskrivna spädbarn och kommer att inkludera tidal andningsanalys och Nitrogen Washout-test. Spädbarnen kommer att placeras i ryggläge, under lugn, naturlig sömn, enligt American Thoracic Society/European Respiratory Societys rekommendationer med mätning av lungvolymer, flöde, funktionell restkapacitet, Lung Clearence Index 5% (LCI 5), Lung Clearence Index 2,5% (LCI 2,5), tid till topptidal utandningsflöde/expirationstid förhållande (tPTEF/tE). Lungultraljud kommer att utföras för att utesluta lungavvikelser. Efter att ha tillåtit anpassning till masken kommer tidvattenandning, flödesvolymslingor i >2 minuter eller >20 artefaktfria andetag att registreras. PFT kommer att göras för att relatera de funktionella andningsdata med de av genererad biokemisk profil. Eventuella samband mellan lungfunktion, biokemiska markörer strax före födseln och hos spädbarn vid 6-12 månaders ålder och antropometriska mätningar kommer att studeras. Lungutveckling och funktion under extrauterint liv kommer att relateras till prenatala mätningar. Data som är lämpliga för spädbarn i gestationsålder (AGA), små för spädbarn för gestationsålder (SGA) och stora för spädbarn i gestationsålder (LGA) kommer att jämföras.

Metoder för datainsamling Flera typer av data kommer att samlas in, inklusive kvantitativa, kvalitativa, genererade från bild-, vävnads- och blodprover. Klinisk data för mål 1, 2 och 3 kommer att samlas in och hanteras med hjälp av REDCaps elektroniska datainsamlingsverktyg som finns hos UO1- Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli-IRCCS (https://redcap-irccs.policlinicogemelli.it/).

Ett särskilt elektroniskt fallrapportformulär (eCRF) kommer att utvecklas. Pseudo-anonimiserad data kommer att samlas in från de inblandade enheterna. Utredaren kommer att vara ansvarig för att se till att eCRF är korrekt och fullständigt ifyllt. Källor till klinisk information inkluderar läkarens patientjournal, sjukhusanteckningar, originallaboratoriejournaler, apoteksjournaler, resultat av ultraljudsundersökning etc.

Statistisk plan Primär endpoint för studien är att identifiera om kliniska, demografiska, laboratorie- och andra parametrar kan förutsäga utvecklingen av kronisk lungsjukdom vid 36 veckors PMA och/eller av onormal lungfunktion vid 12 månaders ålder. Om man antar en acceptabel noggrannhetsnivå, med en area under ROC-kurvan på minst 0,75 ± 0,15, krävs en provstorlek på 42 patienter.

Statistisk analys Provet kommer att beskrivas i sina kliniska och demografiska egenskaper med hjälp av lämpliga beskrivande statistikindex. På djupet kommer kvalitativa data att uttryckas som absolut och relativ procentuell frekvens, medan kvantitativa variabler som antingen medelvärde och standardavvikelse (SD) eller median- och interkvartilintervall (IQR), beroende på fallet. För att verifiera den Gaussiska fördelningen av kvantitativa variabler kommer Shapiro-Wilk-testet att tillämpas. Skillnader mellan grupper vid baslinjen kommer att utvärderas, med avseende på kvalitativa data, antingen genom Chi-Squared-testet eller Fisher-Freeman-Haltons exakta test, beroende på vad som är lämpligt. Kvantitativ data kommer istället att jämföras med Students t-test för oberoende urval eller Mann Withneys icke-parametriska U-test, beroende på datafördelningen. Violinplots kommer att användas för att grafiskt representera signifikanta eller kliniskt relevanta skillnader. Utvärderingen av skillnaden i termer av primärt utfall efter 12 månader kommer att utvärderas med Kaplan-Meier överlevnadsanalys. I synnerhet kommer log-rank testet att tillämpas och lämpliga kumulativa incidenskurvor kommer att ritas. För att bedöma potentiella prediktorer för det primära resultatet efter 12 månader kommer uni- och multivariabla Cox-regressionsmodeller att anpassas. På djupet kommer de potentiella prediktorerna för utfallet att utvärderas med hjälp av vanliga Cox-regressionsmodeller för proportionell hazard, och Hazard Ratios (HR) och 95 % konfidensintervall (CI) kommer följaktligen att rapporteras. Proportionaliteten hos riskfunktionerna kommer att utvärderas genom visuell inspektion av farorna och Schoenfeld-restområdena. Vid tveksam proportionalitet kommer Cox-vägda regressionsmodeller att monteras. Prediktorer som ska inkluderas i den multivariabla modellen kommer att väljas baserat på den univariabla analysen (p<0,05 eller suggestiv, dvs. 0,05 p <0,10) och expertutlåtande, i överensstämmelse med regeln om minst 10 händelser efter utfallsvariabel, och TRIPOD-rekommendationer. Modellens prestanda kommer att utvärderas av flera index, såsom Cindex, Somers Dxy-rank korrelation, Nagelkerkes R2-värde, kalibreringsintercept och slop. C-indexet kan tolkas som en AUC, det vill säga ett mått på modellens noggrannhet. Statistisk signifikans sätts för värden p<0,05. Suggestiva p-värden (0,05, p < 0,10) kommer också att rapporteras. Statistiska analyser kommer att utföras med hjälp av STATA (StataCorp, USA) och R (https://www.r-project.org/).