Профилактика хронических заболеваний легких (CLD – профилактическое исследование)

Актуальность проблемы Хроническая болезнь легких (ХЗЛ) является одним из наиболее частых осложнений перинатального повреждения легких, которое представляет собой системное состояние с долгосрочными последствиями, такими как стойкая легочная дисфункция, астмоподобные симптомы и BPCO. CLD распознает множество пренатальных факторов риска, включая курение матери, хориоамнионит и задержку внутриутробного развития (ЗВУР), помимо постнатальных факторов риска, таких как гипероксия, парентеральное питание, воспаление и искусственная вентиляция легких. Воздействие воспаления внутриутробно изменяет развитие иммунитета новорожденных и предрасполагает легкие плода к дисрегуляции длительного ответа на инвазивную искусственную вентиляцию легких и супрафизиологический кислород. Реакция на повреждающее (и защитное) влияние в раннем возрасте модулируется генетическими и эпигенетическими механизмами, что может привести к постоянным структурным изменениям со значительными последствиями во взрослом возрасте. Беременность с ЗВУР характеризуется повышенным оксидативным стрессом, а дети с ЗВУР подвергаются высокому риску сердечно-сосудистых заболеваний, метаболического синдрома, дисфункции легких и хронических заболеваний почек и органов дыхания во взрослом возрасте. до сих пор не разработано эффективного лечения, которое могло бы привести к профилактике ХЗЛ.

Цели

1. проспективно идентифицировать потенциальные биомаркеры, способные предсказать тяжелое течение легочной функции в первые 12 месяцев жизни и реализовать новый профиль для раннего выявления новорожденных с высоким риском.
2. обнаружить модель причинно-следственной связи генетической изменчивости (с помощью платформы MiSeq Illumina), коррелирующую с тяжелой легочной дисфункцией и развитием астмы.
3. обнаружить микроРНК, а также варианты анти- и провоспалительных цитокинов (MIP-1a, MCP-1, IL-8, TNF-a, IFN-g, IL-10), коррелирующие с тяжестью легочной дисфункции в первые 12 месяцев. жизни и риск развития астмы.

План эксперимента Это многоцентровое продольное исследование, основной целью которого является выявление нового неонатального профиля высокого риска развития хронической болезни легких (ХЗЛ), начиная с перинатального периода жизни. Для достижения этой цели все отделения-участники будут брать вагинальные мазки у зарегистрированных матерей, собирать образцы плаценты и пуповинной крови при рождении, а также образцы периферической крови, жидкости бронхоальвеолярного лаважа (ЖБАЛ), мекония и кала у всех включенных в исследование новорожденных. Исследование начнется с оценки пренатальных факторов риска.

После родов плаценты фиксируют в 10% забуференном формалине. Впоследствии макроскопические и микроскопические анализы будут выполнены в соответствии с консенсусным заявлением Амстердамской группы плацентарного семинара. Во время родов у всех участвующих женщин будут взяты вагинальные мазки. Три мл пуповинной крови (артерии и/или вены) будут взяты для анализа микроРНК, генетической изменчивости и цитокинов. Только у интубированных младенцев образец ЖБАЛ можно получить путем закапывания 1 мл/кг 0,9% раствора хлорида натрия в эндотрахеальную трубку и отсасывания жидкости в стерильную ловушку для слизи. Первый образец ЖБЖ будет собран в течение первых 24 часов жизни, тогда как последующие образцы ЖБЖ будут собираться на 7 и 28 день жизни у новорожденных, которые все еще будут интубированы. Первый образец мекония после рождения и дополнительные образцы кала будут собраны на 7, 28 день жизни, 6 и 12 месяцев жизни. Вагинальные мазки, плацента, ЖБЖ, меконий и образцы фекалий будут храниться при -80°C до дальнейшей обработки. Для каждого образца экстракция бактериальной ДНК будет проводиться на строго контролируемом рабочем месте уровня 2 биологической безопасности с использованием наборов ДНК DANAGENE MICROBIOME (Danagen-Bioted) в соответствии с инструкциями производителя.

В пуповинной сыворотке при рождении (артерия) и на 48 часах жизни будут изучены 8-10 миРНК-кандидатов, в частности миР-451, миР-29b и миР-16, поскольку было показано, что они оказывают ингибирующее действие на ангиогенез посредством подавления фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и миР связан с генетической предрасположенностью к ХЗЛ. Модель причинно-следственной связи генетической изменчивости будет выполнена у всех включенных в исследование новорожденных через 48 часов жизни (не менее 500 мкл цельной крови) с использованием платформы MiSeq Illumina, позволяющей применять технологии секвенирования следующего поколения.

Для выявления изменений анти- и провоспалительных цитокинов, коррелирующих с тяжестью заболевания с течением времени, у включенных детей при поступлении (в течение 48 часов жизни) будут взяты образцы пуповинной и периферической крови (2 мл в пробирку с ЭДТА). , на 7 и 28 дни жизни, на 6 и 12 мес. Будут исследованы уровни как анти- (INF-y), так и провоспалительных (IL-6 и NGF) цитокинов. Все образцы будут храниться при температуре -80 °C до проведения испытаний. Цитокины будут измеряться с помощью коммерчески доступного набора ELISA в соответствии с инструкциями производителя.

Исследователи также попытаются изучить связь между данными матери и плаценты с анализом новорожденных в первые дни жизни. При поступлении новорожденного в отделение интенсивной терапии новорожденных значительное внимание будет уделяться установлению степени и изменений гемооксигенации, а также наличия инфекции, которая является причиной окислительного стресса (ОС) и заболеваний, связанных с ОС. Будут собраны следующие образцы: 1 мл периферической крови (в течение 48 часов жизни). Дополнительные образцы периферической крови будут взяты на 7 и 28 день жизни, на 6 и 12 месяце жизни.

Окислительный стресс (ОС) и липидные медиаторы, участвующие в ОС, будут оцениваться как по биомаркерам окислительного повреждения белков (Advanced Oxidation Protein Products, AOPP), так и по перекисному окислению липидов (изопростаны, IsoPs). Дальнейшая оценка профиля окислительного стресса будет проводиться путем измерения молекул неферментативных антиоксидантов (витамин Е; глутатион, GSH и аскорбиновая кислота, AA) и ферментных молекул антиоксидантов (супероксиддисмутаза, SOD, каталаза, CAT и глутатионпероксидаза, GPx). ). С этой целью будут использоваться высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и масс-спектрометрия с интерфейсом газовой хроматографии (ГХ-МС): ВЭЖХ для обнаружения витамина Е, глутатиона, GSH и АК.

Последним шагом будет проспективное определение нового профиля новорожденных с высоким риском тяжелой легочной дисфункции в первые 12 месяцев жизни, с более высоким риском развития астмы и ХОБЛ в более позднем возрасте. У всех включенных в исследование младенцев будет проведен долгосрочный анализ, чтобы выяснить взаимосвязь между анализом плаценты, экспрессией микроРНК, воспалением и микробиотой - как часть внутриутробного воздействия (хориоамнионит или задержка роста плода) и окислительным стрессом с воспалением - как часть послеродового периода. факторы (инвазивная респираторная поддержка, открытый артериальный проток, пневмония, сепсис) - с легочным исходом в виде нарушения функции легких в 6 и 12 мес.

В возрасте 6 и 12 месяцев младенцы пройдут клиническое и легочное обследование. Функциональный тест легких (PFT) будет проводиться всем включенным в исследование младенцам и будет включать анализ спокойного дыхания и тест на вымывание азота. Младенцы будут помещены в положение лежа на спине во время спокойного естественного сна в соответствии с рекомендациями Американского торакального общества/Европейского респираторного общества с измерением объемов легких, потока, функциональной остаточной емкости, индекса клиренса легких 5% (LCI 5), клиренса легких. Индекс 2,5% (LCI 2,5), отношение времени до пиковой дыхательной скорости выдоха/времени выдоха (tPTEF/tE). УЗИ легких будет проведено, чтобы исключить аномалии легких. После адаптации к маске будут записываться циклы спокойного дыхания, объема потока в течение >2 минут или >20 вдохов без артефактов. PFT будет проводиться для того, чтобы связать функциональные респираторные данные с данными созданного биохимического профиля. Будут изучены любые возможные взаимосвязи между функцией легких, биохимическими маркерами непосредственно перед рождением и у детей в возрасте 6–12 месяцев, а также антропометрическими измерениями. Развитие и функция легких во время внеутробной жизни будут связаны с пренатальными измерениями. Будут сравниваться данные для младенцев, соответствующих гестационному возрасту (AGA), маленьких для гестационного возраста (SGA) и крупных для гестационного возраста (LGA) младенцев.

Методы сбора данных Будет собрано несколько типов данных, включая количественные, качественные, полученные на основе визуализации, образцов тканей и крови. Клинические данные для целей 1, 2 и 3 будут собираться и обрабатываться с использованием инструментов электронного сбора данных REDCap, размещенных в UO1- Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli-IRCCS (https://redcap-irccs.poliliclinicogemelli.it/).

Будет разработана специальная электронная форма отчета о случае (eCRF). Псевдоанонимизированные данные будут собираться от задействованных подразделений. Следователь будет нести ответственность за правильность и полноту заполнения электронной ИРК. Источниками клинической информации являются истории болезни врача, больничные записи, оригинальные лабораторные записи, аптечные записи, результаты ультразвукового исследования и т. д.

Статистический план Первичной конечной целью исследования является определение того, способны ли клинические, демографические, лабораторные и другие параметры предсказать развитие хронического заболевания легких на 36 неделе ПМА и/или аномальной функции легких в возрасте 12 месяцев. Предполагая приемлемый уровень точности и площадь под кривой ROC не менее 0,75 ± 0,15, требуется размер выборки в 42 пациента.

Статистический анализ Выборка будет описана по ее клиническим и демографическим характеристикам с использованием соответствующих показателей описательной статистики. Более подробно, качественные данные будут выражаться как абсолютная и относительная процентная частота, а количественные переменные — как среднее и стандартное отклонение (SD) или медиана и межквартильный размах (IQR), в зависимости от случая. Для проверки гауссовского распределения количественных переменных будет применен тест Шапиро-Уилка. Различия между группами на исходном уровне будут оцениваться с учетом качественных данных либо с помощью критерия Хи-квадрат, либо с помощью точного критерия Фишера-Фримена-Халтонса, в зависимости от ситуации. Вместо этого количественные данные будут сравниваться с использованием t-критерия Стьюдента для независимых выборок или непараметрического U-критерия Манна Уитни, в зависимости от распределения данных. Скрипичные графики будут использоваться для графического представления значимых или клинически значимых различий. Оценка разницы с точки зрения первичного результата через 12 месяцев будет оцениваться с помощью анализа выживаемости Каплана-Мейера. В частности, будет применен логранговый критерий и построены соответствующие кривые кумулятивной заболеваемости. Для оценки потенциальных предикторов основного результата через 12 месяцев будут подобраны одно- и многомерные модели регрессии Кокса. Более подробно потенциальные предикторы результата будут оценены с помощью обычных регрессионных моделей Кокса с пропорциональными рисками, после чего будут сообщены коэффициенты рисков (HR) и 95% доверительные интервалы (CI). Пропорциональность функций опасности будет оцениваться путем визуального осмотра опасностей и графиков остатков Шенфельда. В случае сомнений в пропорциональности будут подобраны модели взвешенной регрессии Кокса. Предикторы, которые будут включены в многомерную модель, будут выбраны на основе однофакторного анализа (p<0,05 или суггестивного, т.е. 0,05 p<0,10) и мнения экспертов, в соответствии с правилом не менее 10 событий по переменной результата, а также рекомендациями TRIPOD. Производительность модели будет оцениваться по нескольким индексам, таким как Cindex, Dxy-ранговая корреляция Сомерса, значение R2 Нагелькерке, калибровочная точка пересечения и наклон. C-индекс можно интерпретировать как AUC, т.е. меру точности модели. Статистическую значимость устанавливают для значений р<0,05. Также будут сообщены предполагаемые значения p (0,05, p <0,10). Статистический анализ будет проводиться с использованием STATA (StataCorp, США) и R (https://www.r-project.org/).