Prévention des maladies pulmonaires chroniques (CLD - Prevention Study)

Contexte La maladie pulmonaire chronique (CLD) est l'une des complications les plus courantes des lésions pulmonaires périnatales qui représente une affection systémique avec des séquelles à long terme, telles qu'un dysfonctionnement pulmonaire persistant, des symptômes de type asthmatique et BPCO. La CLD reconnaît de nombreux facteurs de risque prénatals, notamment le tabagisme maternel, la chorioamnionite et le retard de croissance intra-utérin (RCIU), en plus des facteurs de risque postnatals tels que l'hyperoxie, la nutrition parentérale, l'inflammation et la ventilation mécanique. L'exposition à l'inflammation in utero altère le développement immunitaire néonatal et prédispose le poumon fœtal à une réponse prolongée dérégulée à la ventilation mécanique invasive et à l'oxygène supraphysiologique. Les réponses aux influences néfastes (et protectrices) au début de la vie sont modulées par des mécanismes génétiques et épigénétiques, qui pourraient entraîner des changements structurels permanents ayant des conséquences importantes à l'âge adulte. Les grossesses IUGR sont caractérisées par un stress oxydatif accru et les nourrissons IUGR présentent un risque élevé de maladies cardiovasculaires, de syndrome métabolique, de dysfonctionnement pulmonaire et de maladies rénales et respiratoires chroniques à l'âge adulte. Malgré l'augmentation constante des connaissances sur les mécanismes conduisant à la progression des lésions pulmonaires, Jusqu’à présent, aucune gestion efficace n’a été développée pour conduire à la prévention de la MPC.

Objectifs

1. identifier de manière prospective des biomarqueurs potentiels capables de prédire l'évolution sévère de la fonction pulmonaire au cours des 12 premiers mois de la vie et réaliser un nouveau profil pour identifier précocement les nouveau-nés à haut risque.
2. détecter le modèle de causalité de la variance génétique (par la plateforme MiSeq Illumina) en corrélation avec un dysfonctionnement pulmonaire sévère et le développement de l'asthme.
3. détecter les microARN ainsi que les variations de cytokines anti- et pro-inflammatoires (MIP-1a, MCP-1, IL-8, TNF-a, IFN-g, IL-10) en corrélation avec la gravité du dysfonctionnement pulmonaire au cours des 12 premiers mois de la vie et le risque de développer un asthme.

Conception expérimentale Il s'agit d'une étude longitudinale multicentrique dont l'objectif principal est d'identifier un nouveau profil néonatal à haut risque de développement d'une maladie pulmonaire chronique (MPC), à partir de la vie périnatale. Afin d'atteindre cet objectif, toutes les unités participantes effectueront un prélèvement vaginal sur les mères inscrites, collecteront du placenta et du sang de cordon à la naissance et du sang périphérique, du liquide de lavage broncho-alvéolaire (BALF), du méconium et des échantillons de selles de tous les nouveau-nés inscrits. L'étude débutera par l'évaluation des facteurs de risque prénatals.

Après l'accouchement, les placentas seront fixés dans du formol tamponné à 10 %. Par la suite, des analyses macroscopiques et microscopiques seront effectuées conformément à la déclaration de consensus du groupe de l'atelier placentaire d'Amsterdam. Un écouvillon vaginal sera prélevé au moment de l'accouchement pour toutes les femmes inscrites. Trois ml de sang de cordon (artère et/ou veine) seront effectués pour l'analyse des miARN, de la variance génétique et des cytokines. Chez les nourrissons intubés uniquement, l'échantillon BALF sera obtenu en instillant 1 ml/kg de chlorure de sodium à 0,9 % dans la sonde endotrachéale et en aspirant le liquide dans un piège à mucus stérile. Le premier échantillon BALF sera collecté dans les 24 premières heures de vie, tandis que d'autres échantillons BALF seront collectés à 7 et 28 jours de vie chez les nouveau-nés qui seront toujours intubés. Premier échantillon de méconium après la naissance et des échantillons de matières fécales supplémentaires seront collectés à 7, 28 jours de vie, 6 et 12 mois de vie. Les écouvillons vaginaux, le placenta, le BALF, le méconium et les échantillons de matières fécales seront conservés à -80 °C jusqu'à leur traitement ultérieur. Pour chaque échantillon, l'extraction de l'ADN bactérien sera effectuée dans un lieu de travail de sécurité biologique de niveau 2 strictement contrôlé à l'aide des kits DANAGENE MICROBIOME DNA (Danagen-Bioted) conformément aux instructions du fabricant.

Dans le sérum de cordon à la naissance (artère) et à 48 heures de vie, 8 à 10 miARN candidats, notamment miR-451, miR-29b et miR-16, seront étudiés car il a été démontré qu'ils ont un effet inhibiteur sur L'angiogenèse par suppression du facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) et du miR est associée à la susceptibilité génétique à la CLD. Le modèle de causalité de la variance génétique sera réalisé chez tous les nouveau-nés inscrits à 48 heures de vie (au moins 500 μL de sang total) à l'aide d'une plateforme MiSeq Illumina permettant l'application des technologies de séquençage de nouvelle génération.

Pour détecter les variations de cytokines anti- et pro-inflammatoires en corrélation avec la gravité de la maladie au fil du temps, des échantillons de sang de cordon et de sang périphérique (2 ml dans un tube EDTA) seront prélevés sur les nourrissons inclus à l'admission (dans les 48 heures suivant la vie) , à 7 et 28 jours de vie, à 6 et 12 mois. Les niveaux de cytokines anti- (INF-y) et pro-inflammatoires (IL-6 et NGF) seront étudiés. Tous les échantillons seront conservés à -80 °C jusqu'aux tests. Les cytokines seront mesurées avec un kit ELISA disponible dans le commerce selon les instructions du fabricant.

Les enquêteurs tenteront également d'explorer l'association entre les données de la mère et du placenta avec l'analyse des nouveau-nés pendant les premiers jours de la vie. Lors de l'admission du nouveau-né à l'unité de soins intensifs néonatals, une attention considérable sera portée à la vérification du degré et des variations de l'hémo-oxygénation, ainsi que de la présence d'une infection à l'origine du stress oxydatif (OS) et des maladies liées à l'OS. Les échantillons suivants seront collectés : 1 ml de sang périphérique (dans les 48 heures suivant la vie). Des échantillons de sang périphérique supplémentaires seront prélevés à 7 et 28 jours de vie, à 6 et 12 mois de vie.

Le stress oxydatif (OS) et les médiateurs lipidiques impliqués dans l'OS seront évalués à la fois par des biomarqueurs des dommages protéiques oxydatifs (Advanced Oxidation Protein Products, AOPP) et de la peroxydation lipidique (Isoprostanes, IsoPs). Une évaluation plus approfondie du profil de stress oxydatif sera réalisée en mesurant les molécules antioxydantes non enzymatiques (vitamine E ; glutathion, GSH et acide ascorbique, AA) et les molécules antioxydantes enzymatiques (superoxyde dismutase, SOD, catalase, CAT et glutathion peroxydase, GPx). ). À cette fin, la chromatographie liquide haute performance (HPLC) et la spectrométrie de masse interfacée par chromatographie en phase gazeuse (GC-MS) seront utilisées : HPLC pour détecter la vitamine E, le glutathion, le GSH et l'AA.

La dernière étape consistera à identifier de manière prospective un nouveau profil de nouveau-nés à haut risque de dysfonctionnement pulmonaire sévère au cours des 12 premiers mois de la vie, présentant un risque plus élevé de développer de l'asthme et de la BPCO à un âge plus avancé. Un résultat à long terme de tous les bébés inscrits sera réalisé pour démêler les relations entre l'analyse du placenta, l'expression des miARN, l'inflammation et le microbiote - dans le cadre de l'exposome in utero (chorioamnionite ou retard de croissance fœtal) et le stress oxydatif avec inflammation - dans le cadre du suivi postnatal. facteurs (assistance respiratoire invasive, persistance du canal artériel, pneumonie, sepsis) - avec l'issue pulmonaire en termes de fonction pulmonaire anormale à 6 et 12 mois.

À 6 et 12 mois, les nourrissons recevront une évaluation clinique et pulmonaire. Un test de la fonction pulmonaire (PFT) sera effectué chez tous les nourrissons inscrits et comprendra une analyse respiratoire par marée et un test de lavage à l'azote. Les nourrissons seront placés en position couchée, pendant un sommeil calme et naturel, selon les recommandations de l'American Thoracic Society/European Respiratory Society avec mesure des volumes pulmonaires, du débit, de la capacité résiduelle fonctionnelle, de l'indice de clairance pulmonaire 5 % (LCI 5), de la clairance pulmonaire. Indice 2,5 % (LCI 2,5), rapport temps jusqu'au débit expiratoire courant maximal/temps expiratoire (tPTEF/tE). Une échographie pulmonaire sera réalisée pour exclure des anomalies pulmonaires. Après avoir permis l'adaptation au masque, la respiration courante, les boucles de volume de débit pendant >2 minutes ou >20 respirations sans artefacts seront enregistrées. Un PFT sera réalisé afin de relier les données respiratoires fonctionnelles avec celles du profil biochimique généré. Toutes les relations possibles entre la fonction pulmonaire, les marqueurs biochimiques juste avant la naissance et chez les nourrissons âgés de 6 à 12 mois et les mesures anthropométriques seront étudiées. Le développement et la fonction pulmonaires pendant la vie extra-utérine seront liés aux mesures prénatales. Les données adaptées aux nourrissons en âge gestationnel (AGA), aux nourrissons petits pour l'âge gestationnel (SGA) et aux nourrissons grands pour l'âge gestationnel (LGA) seront comparées.

Méthodes de collecte de données Plusieurs types de données seront collectées, notamment quantitatives, qualitatives, générées à partir d'échantillons d'imagerie, de tissus et de sang. Les données cliniques pour les objectifs 1, 2 et 3 seront collectées et gérées à l'aide des outils électroniques de capture de données REDCap hébergés à l'UO1- Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli-IRCCS (https://redcap-irccs.policlinicogemelli.it/).

Un formulaire électronique dédié de rapport de cas (eCRF) sera développé. Des données pseudo-anonymisées seront collectées auprès des unités impliquées. L'enquêteur sera chargé de s'assurer que l'eCRF est correctement et entièrement rempli. Les sources d'informations cliniques comprennent le dossier patient du médecin, les notes d'hôpital, les dossiers de laboratoire originaux, les dossiers de pharmacie, les résultats de l'échographie, etc.

Plan statistique Le critère d'évaluation principal de l'étude est d'identifier si les paramètres cliniques, démographiques, de laboratoire et autres sont capables de prédire le développement d'une maladie pulmonaire chronique à 36 semaines de PMA et/ou d'une fonction pulmonaire anormale à 12 mois. En supposant un niveau de précision acceptable, avec une aire sous la courbe ROC d'au moins 0,75 ± 0,15, un échantillon de 42 patients est requis.

Analyse statistique L'échantillon sera décrit dans ses caractéristiques cliniques et démographiques en utilisant les indices statistiques descriptifs appropriés. En profondeur, les données qualitatives seront exprimées en pourcentage de fréquence absolue et relative, tandis que les variables quantitatives en moyenne et écart type (SD) ou médiane et intervalle interquartile (IQR), selon le cas. Pour vérifier la distribution gaussienne des variables quantitatives, le test de Shapiro-Wilk sera appliqué. Les différences entre les groupes au départ seront évaluées, en ce qui concerne les données qualitatives, soit par le test du Chi carré, soit par le test exact de Fisher-Freeman-Haltons, selon le cas. Les données quantitatives seront plutôt comparées à l'aide du test t de Student pour des échantillons indépendants ou du test U non paramétrique de Mann Withney, selon la distribution des données. Les tracés en violon seront utilisés pour représenter graphiquement les différences significatives ou cliniquement pertinentes. L'évaluation de la différence en termes de résultat principal à 12 mois sera évaluée par analyse de survie de Kaplan-Meier. En particulier, le test du log-rank sera appliqué et des courbes d'incidence cumulative appropriées seront tracées. Afin d'évaluer les prédicteurs potentiels du résultat principal à 12 mois, des modèles de régression de Cox uni et multivariés seront adaptés. En profondeur, les prédicteurs potentiels du résultat seront évalués au moyen de modèles de régression de Cox à risque proportionnel ordinaires, et les rapports de risque (HR) et les intervalles de confiance (IC) à 95 % seront par conséquent rapportés. La proportionnalité des fonctions de danger sera évaluée par inspection visuelle des dangers et des parcelles résiduelles de Schoenfeld. En cas de proportionnalité douteuse, des modèles de régression pondérés de Cox seront adaptés. Les prédicteurs à inclure dans le modèle multivarié seront sélectionnés sur la base de l'analyse univariée (p <0,05 ou suggestive, c'est-à-dire 0,05 p <0,10) et de l'opinion d'experts, conformément à la règle d'au moins 10 événements par variable de résultat et aux recommandations du TRIPOD. Les performances du modèle seront évaluées par plusieurs indices, tels que le Cindex, la corrélation Somers Dxy-rank, la valeur R2 de Nagelkerke, l'ordonnée à l'origine et la pente. L'indice C peut être interprété comme une AUC, c'est-à-dire une mesure de la précision du modèle. La signification statistique est définie pour les valeurs de p <0,05. Des valeurs p suggestives (0,05, p <0,10) seront également signalées. Les analyses statistiques seront menées à l'aide de STATA (StataCorp, USA) et R (https://www.r-project.org/).