インプラント周囲炎の治療におけるインプラント形成術の評価。

1. 参加者：インプラント周囲炎と診断された成人患者（Caton etal。2018、Papanou etal。2018）が含まれます。患者は、前述の症例対照研究で研究された集団から募集され、インプラント周囲炎と診断されました。包含および除外基準は、ケースコントロール研究で以前に定義された基準に従います。
2. 参加者の割り当て：参加者は、グループ1（インプラント形成術）とグループ2（外科的アクセス）の2つのグループにランダムに割り当てられます。 - 割り当ては、コンピューター化されたランダム化システム（Sealed Envelope.com）によって実行されます。
3. 臨床手順：グループ1（インプラント形成術）：罹患したインプラントは、洗浄を促進し、侵害された領域を除去するためにインプラント表面のリモデリングを伴うインプラント形成術を受けます。 グループ2（外科的アクセス）：罹患したインプラントは、炎症を起こした組織の機械的除去とインプラント表面の洗浄により、外科的アクセスによって治療されます。
4. 臨床評価：最初の臨床パラメーターは、処置前および特定の間隔で記録されます（処置後1、3、および6か月後）。プラーク指数を含む歯周植物指数と周囲のインデックス、プロービング、プローブの深さ、臨床付着レベルの出血は、較正された審査官によって評価されます。

5. バイオフィルム（ミクロビオーム）収集と分析：歯周病およびインプラント周囲のバイオフィルムサンプルは、分類学的分析のために収集されます。 すべてのサンプルは、歯周検査の前に取得されます。 サブジンゲイバル/粘膜下バイオフィルムコレクションの前に、滅菌キュレットを使用して、超距離/滑球性バイオフィルムを慎重に除去します。 この部位は、綿のロールを使用して分離され、唾液による汚染を避けるために、エアシリンジで静かに乾燥させます。 バイオフィルムサンプルは、歯/インプラントの頬面から標準的なろ紙ポイントによって取得されます。 ろ紙ポイントは歯肉/ペリインプラント溝に挿入され、30秒間その所定の位置に残されます。 紙のスポットは、Tris-EDTA溶液を含む微小遠心性チューブに入れられます。 すべてのサンプルはすぐに凍結され、実験室分析まで-20°Cで保存されます。 バイオフィルムサンプルは、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）200 µLを添加し、1分間ボルテックスすることにより、紙ストリップから除去されます。 製造業者の推奨事項に従って、Qiagen Miniamp Kit（カリフォルニア州バレンシア）を使用して、ペーパースポットが削除され、DNAが分離されます。 口腔予防または非外科的歯周治療は、サンプル収集前に開始されず、被験者は必要に応じて歯周治療プログラムに登録されます。

   DNAシーケンスとデータ分析：16S RRNA遺伝子のV3-V4過可視領域は、Klindworth et al。 （2013）。 メーカーの推奨によると、PCR精製は、0.8ビーズ/PCR体積の比率で磁気ビーズ（Ampure XP Bead、Beckman Agencourt）を使用して実行されます。 アダプターのライゲーション後、1.12ビーズ/PCR体積の比率で、磁気ビーズ（Ampure XP Bead、Beckman Agencourt）を使用して新しいPCR精製を実行します。 ライブラリ正規化は、SequalPrep™正規化プレートキット（96）（Applied Biosystems™）を使用して実行され、複合ライブラリが定量化されます。 等モルDNA濃度をプールし、Illumina Miseqプラットフォームでシーケンスして、300 bpのペアエンドシーケンスを生成します。 QIIME 2 2020.6（Bolyen et al。、2019）を使用して、バイオインフォマティック分析を実行します。 非複数のFASTQファイルはシーケンス施設から取得され、Q2-DADA2で実行される除去プロセスの前にプライマーを除去するためにQ2 Cutadapt（Martin、2011）を使用します（Callahan et al。、2016）。 整列からツリーへのMafft-Fasttree（Q2-Phylogeny）パイプラインを使用して、すべてのアンプリコンシーケンスバリアント（ASV）をMAFFT（Katoh et al。、2002）と整列させ、FastTree2で系統発生を構築します（Price et al。、2010）。 分類法は、拡張されたヒト口腔微生物叢データベース（EHOMD、v15.2）に対して訓練されたNaive Bayes Taxonomy分類器Q2-Feature-Classifier（Bokulich etal。2018a）を使用してASVに割り当てられます（Escapa et al。、2018）。 Alpha-diversity metrics (Shannon (Spellerberg, 2003)), beta-diversity metrics (weighted UniFrac (Lozupone et al. 2007), unweighted UniFrac (Lozupone et al. 2005)), and Principal Coordinates Analysis (PCoA) will be estimated using the q2-diversity core-metrics-phylogenetic pipeline after samples are rarefied toサンプルあたり10591シーケンス。 アルファ多様性の違い（サンプル内の違い）は、ペアワイズの違いを使用して測定されます（Bokulich etal。2018b）。 ベータの多様性（サンプル間の違い）の場合、グループ間の違いは、PermavaとPermDisp（Q2-Diversity）テストを使用して測定されます。 コアマイクロビオーム（グループ内のサンプルの少なくとも50％に存在する種としてコアマイクロビオームを考慮して）は、Q2フィーチャーテーブル種レベルのテーブルのコア機能を使用して計算されます。 視覚化は、Q2-Feature-Tableヒートマップ（種の相対的な存在量を視覚化するため）と植物質（Dabdoub et al。、2016）を使用して実行されます。 種間の差は、Ancom-BC（Lin＆Peddada、2020）を使用して計算されます。

6. 炎症性分析：インプラント周囲の硬膜液と壊死症からの肉芽組組織は、植物周囲炎で治療された部位で、研究に関与するすべての個人から収集されます。 材料の収集中、問題のサイトは適切に分離され、滅菌された綿のロールで乾燥します。 supragingialバイオフィルムは除去され、歯肉液のサンプルは、歯と歯周ティッシュ界面の間に30秒間紙ポイントを挿入することにより得られます（Casarin etal。2010）。 サイトごとに2つのペーパーポイントが使用され、適切な量の硬膜液が得られます。 収集された液体の体積は、ペリオトロン（Periotron 8000、Proflow Inc.、Amityville、NY、USA）で測定され、紙のスポットは、150 µLのリン酸緩衝液（PBS）および0.05％Tween-Tween-20で個々のおよび実験期間をコード化します。 インプラントのスクレイピング中に除去された顆粒組織は、RNALATERに保存され、-80Cで凍結されます。 サンプルは、後の分析のために保存されます。 分析の前に、サンプルはMilliporeキットから60 µLのバッファーで希釈し、30分間ボルテックスしてから10,000 rpmで10分間遠心分離します。 各歯肉液のサンプルは、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、TNFα、IFN-Δについて、ルミネックス/マグピックステクノロジーによって分析されます。 簡単に言えば、分析の前に、サンプルをPBSバッファー + 5％Tweenで希釈し、30秒間ボルテックスします。 穏やかな遠心分離の後、25 µLの上清を、各サイトカイン/プロテアーゼに特異的な免疫標識ビーズとともに96ウェルプレートに入れます。 ビーズとのインキュベーション後、二次抗体と基質が提供され、プレートはマグピックスプラットフォームを使用して読み取られます。 各分析物の濃度はpg/µlで発現します。 分析の検出限界を下回る定量化のサンプルは「ゼロ」として記録され、標準曲線の定量化制限を超えるサンプルは、曲線の最高値に等しい値で記録されます。
7. 統計分析： - 統計分析が実行され、追跡期間を通じてグループ間で臨床パラメーター、ミクロビオーム組成、サイトカイン発現を比較します。 - 2つの手順間の有効性の違いが評価されます。

この研究のすべての分析は、ピラシカバ歯科学部の歯周病領域の研究研究所で実施されます。