임플란트 주위염 치료에서 임플란트 성형술 평가.

1. 참가자 : 임플란트 주위염 진단을받은 성인 환자 (Caton et al. 2018, Papapanou et al. 2018)가 포함됩니다. 환자는 임플란트 주위염 진단을받은 전술 한 사례 관리 연구에서 연구 된 인구로부터 모집됩니다. 포함 및 제외 기준은 사례 관리 연구에서 이전에 정의 된 기준을 따릅니다.
2. 참가자 할당 : 참가자는 그룹 1 (임플란트 성형술)과 그룹 2 (수술 접근)의 두 그룹으로 무작위로 할당됩니다. - 할당은 전산화 된 무작위 화 시스템 (봉인 된 envelope.com)에 의해 수행됩니다.
3. 임상 절차 : 그룹 1 (임플란트 성형술) : 영향을받는 임플란트는 임플란트 표면의 리모델링을 포함하여 청소를 용이하게하고 손상된 영역을 제거하는 임플란트 성형술을받습니다. 그룹 2 (수술 접근) : 영향을받는 임플란트는 염증성 조직의 기계적 제거 및 임플란트 표면의 청소와 함께 외과 적 접근을 통해 처리됩니다.
4. 임상 평가 : 초기 임상 파라미터는 절차 전에 및 특정 간격 (절차 후 1, 3 및 6 개월)으로 기록됩니다. 플라크 지수, 프로브에 대한 출혈, 프로브 깊이 및 임상 부착 수준을 포함한 치주 및 임플란트 지수는 교정 검사관에 의해 평가됩니다.

5. 바이오 필름 (마이크로 바이 옴) 수집 및 분석 : 분류 분석을 위해 치주 및 임플란트 바이오 필름 샘플을 수집합니다. 모든 샘플은 치주 검사 전에 얻을 수 있습니다. 하위 깅 기이/점막하 바이오 필름 수집 이전에, 멸균 곡선을 사용하여 Supragingival/supramucosal biofilm을 신중하게 제거 할 것이다. 이 부지는면 롤을 사용하여 분리하고 타액으로 오염되지 않도록 공기 주사기로 부드럽게 건조됩니다. 바이오 필름 샘플은 치아/임플란트의 협측 표면의 표준 필터 지점에 의해 얻어 질 것이다. 필터 용지 지점은 치은/임플란트 설 쿠스에 삽입되어 30 초 동안 제자리에 남아 있습니다. 종이 반점은 트리스 -EDTA 용액을 포함하는 미세 원심 분리 튜브에 배치됩니다. 모든 샘플은 실험실 분석까지 즉시 동결되고 -20 ℃에서 저장 될 것이다. 바이오 필름 샘플은 200 ㎕의 인산염 완충 식염수 (PBS)와 Vortexing을 1 분 동안 첨가하여 종이 스트립에서 제거 할 것이다. 제조업체의 권장 사항에 따라 Qiagen Miniamp Kit (Valencia, CA)를 사용하여 종이 스팟을 제거하고 DNA를 분리합니다. 구강 예방 또는 비수술 치주 치료는 샘플 수집 전에 시작되지 않으며, 대상체는 필요에 따라 치주 치료 프로그램에 등록됩니다.

   DNA 시퀀싱 및 데이터 분석 : 16S rRNA 유전자의 V3-V4 과당 영역은 Klindworth et al.에 의해 이전에 기술 된 프라이머 및 PCR 조건을 사용하여 증폭 될 것이다. (2013). 제조업체의 권장 사항에 따르면, PCR 정제는 0.8 비드/PCR 부피의 비율로 자기 비드 (Ampure XP Bead, Beckman Agencourt)를 사용하여 수행 될 것이다. 어댑터의 결찰 후, 1.12 비드/PCR 부피의 비율로 자기 비드 (Ampure XP Bead, Beckman Agencourt)를 사용하여 새로운 PCR 정제가 수행 될 것이다. 라이브러리 정규화는 SequalpRep ™ 정규화 판 키트 (96) (Applied Biosystems ™)를 사용하여 수행되며 결합 된 라이브러리가 정량화됩니다. 등몰 DNA 농도는 Illumina Miseq 플랫폼에서 300-bp 쌍 엔드 서열을 생성하기 위해 풀링 및 시퀀싱 될 것이다. 생물 정보 분석은 Qiime 2 2020.6을 사용하여 수행 될 것입니다 (Bolyen et al., 2019). Demultiplexed FASTQ 파일은 시퀀싱 시설에서 얻을 수 있으며, Q2 CutAdapt (Martin, 2011)는 Denoising 프로세스 전에 프라이머를 제거하는 데 사용되며, 이는 Q2-DADA2로 수행됩니다 (Callahan et al., 2016). 정렬-트리 Mafft-Fasttree (Q2-Phylogeny) 파이프 라인은 모든 앰플 리콘 서열 변이체 (ASV)를 Mafft (Katoh et al., 2002)와 정렬하고 FastTree2 (Price et al., 2010)와 계통 발생을 구성하는 데 사용됩니다. 분류는 확장 된 인간 구강 미생물 데이터베이스 (EHOMD, v15.2)에 대해 훈련 된 순진한 Bayes 분류기 분류기 Q2-Feature-Classifier (Bokulich et al. 2018a)를 사용하여 ASV에 할당 될 것입니다 (Escapa et al., 2018). 알파 디버시티 메트릭 (Shannon (Shannon (Spellerberg, 2003)), Beta-Diversity Metrics (가중 Unifrac (Lozupone et al. 2007), Unifed Unifrac (Lozupone et al. 2005) 및 주요 좌표 분석 (PCOA)은 Q2Viversity Core-More-Mepline 1을 사용하여 추정 될 것입니다. 샘플 당 시퀀스. 알파 다양성의 차이 (샘플 내 차이)는 쌍별 차이를 사용하여 측정 될 것이다 (Bokulich et al. 2018b). 베타 다양성 (샘플 간의 차이)의 경우, 그룹 간의 차이는 PermanOVA 및 PermDISP (Q2-Diversity) 테스트를 사용하여 측정됩니다. 핵심 미생물 군 (그룹 내 샘플의 50% 이상에 존재하는 종으로서의 핵심 미생물 군집을 고려)은 Q2- 기능 테이블 종 수준 표의 핵심 특징을 사용하여 계산 될 것이다. 시각화는 Q2- 기능 테이블 히트 맵 (상대의 종의 상대적 풍부 성을 시각화하기 위해)과 Phylotoast (Dabdoub et al., 2016)를 사용하여 수행 될 것입니다. 종들 사이의 차등 풍부도는 ANCOM-BC를 사용하여 계산 될 것이다 (Lin & Peddada, 2020).

6. 염증성 분석 : 이식 주변 틈새 유체 및 파편으로부터의 과립 조직은 임플란트 주위염으로 치료 된 부위에서 연구에 관련된 모든 개인으로부터 수집 될 것이다. 재료를 수집하는 동안, 해당 부위는 멸균 된면 롤로 올바르게 분리되고 건조 될 것입니다. Secragingival Biofilm은 제거되고 치은 유체의 샘플은 치아와 치주 조직 계면 사이에 30 초 동안 종이 점을 삽입함으로써 얻어 질 것이다 (Casarin et al. 2010). 적절한 부피의 틈새 액을 얻기 위해 현장 당 두 개의 종이 지점이 사용됩니다. 수집 된 유체의 부피는 Periotron (Periotron 8000, Proflow Inc., 미국 뉴욕 주 Amityville)으로 측정 한 다음 종이 반점을 미세 원심 분리 튜브 (Eppendorf)에 배치하고, 각 개별 및 150 μL의 포스페이트 완충액 (PBS) 및 0.05% 트윈 -20을 갖는 실험 기간에 대해 코딩 할 것이다. 임플란트 스크래핑 동안 제거 된 과립 화 조직은 rnalater에 저장되고 -80C에서 동결된다. 샘플은 나중에 분석을 위해 저장됩니다. 분석 전에, 샘플을 Millipore 키트로부터 60 ㎕의 완충제로 희석하고, 30 분 동안 소용돌이 치은 다음 10,000 rpm에서 10 분 동안 원심 분리 할 것이다. 각각의 치은 유체의 샘플은 Luminex/Magpix 기술에 의한 IL-1β, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17, IL-17, TNFα 및 IFN-δ에 대해 분석 될 것이며, 이는 존재를 결정할뿐만 아니라 동일한 샘플에서 상이한 마커의 농도를 정량화 할 것이다. 간단히 말해서, 샘플은 PBS 완충액 + 5% 트윈으로 희석되고 분석 전에 30 초 동안 소용돌이를 뿌릴 것이다. 온화한 원심 분리 후, 25 ㎕의 상청액을 각 사이토 카인/프로테아제에 특이적인 면역 표지 된 비드와 함께 96- 웰 플레이트에 넣을 것이다. 비드와 함께 배양 한 후, 2 차 항체 및 기질이 제공 될 것이며, 플레이트는 Magpix 플랫폼을 사용하여 읽습니다. 각 분석 물의 농도는 PG/µL로 발현 될 것이다. 분석의 검출 한계 아래에 정량화 된 샘플은 "0"으로 기록되고, 표준 곡선의 정량화 한계 이상의 샘플은 곡선의 가장 높은 값과 동일한 값으로 기록됩니다.
7. 통계 분석 : - 추적 기간 동안 그룹들 사이의 임상 파라미터, 미생물 군집 조성 및 사이토 카인 발현을 비교하기 위해 통계 분석이 수행 될 것이다. - 두 절차 사이의 효능 차이가 평가됩니다.

이 연구의 모든 분석은 Piracicaba School of Dentistry의 치주 지역의 연구 실험실에서 수행 될 것입니다.