Ocena implantoplastyki w leczeniu zapalenia okołoplanowania.

1. Uczestnicy: Dorośli pacjenci zdiagnozowano zapalenie okołoprzepustowe (Caton i in. 2018, Papapanou i in. 2018) zostaną uwzględnione; Pacjenci zostaną rekrutowani z populacji badanej w wyżej wymienionym badaniu kontroli przypadków, u których zdiagnozowano zapalenie okołoprzepustowe; Kryteria włączenia i wykluczenia będą zgodne z kryteriami wcześniej zdefiniowanymi w badaniu kontroli przypadków.
2. Alokacja uczestników: Uczestnicy będą losowo przydzielani na dwie grupy: grupa 1 (implantoplastyka) i grupa 2 (dostęp chirurgiczny). - Alokacja będzie wykonywana przez skomputeryzowany system randomizacji (zapieczętowana Envelope.com).
3. Procedury kliniczne: Grupa 1 (implantoplastyka): Dotknięte implanty ulegną implantoplastykę, obejmującą przebudowę powierzchni implantu w celu ułatwienia czyszczenia i usunięcia zagrożonych obszarów. Grupa 2 (dostęp chirurgiczny): Dotknięte implanty będą leczone poprzez dostęp chirurgiczny, z mechanicznym usuwaniem zapalonej tkanki i czyszczeniem powierzchni implantu.
4. Ocena kliniczna: Wstępne parametry kliniczne zostaną zarejestrowane przed zabiegiem i w określonych odstępach (1, 3 i 6 miesięcy po zabiegu); Wskaźniki przyzębia i implantu, w tym wskaźnik płytki nazębnej, krwawienie z sondowania, głębokość sondowania i poziom przywiązania klinicznego, zostaną ocenione przez skalibrowane egzaminator.

5. Biofilm (mikrobiom) Zbieranie i analiza: pobierane zostaną próbki biofilmu przyzębia i implantu do analizy taksonomicznej. Wszystkie próbki zostaną uzyskane przed badaniem przyzębia. Przed zbieraniem Biofilmu Subgingival/podśluzówkowego biofilm superagival/supramocosal zostanie starannie usunięty przy użyciu sterylnych zębów. Miejsce zostanie wyizolowane za pomocą bawełnianych bułek i delikatnie wysuszone strzykawką powietrzną, aby uniknąć zanieczyszczenia śliną. Próbki biofilmu zostaną uzyskane za pomocą standardowych punktów papieru filtracyjnego z powierzchni policzkowych zębów/implantów. Punkty bibuły filtracyjnej zostaną włożone do bruzdy dziąseł/okołoprzepustki i pozostawione na miejsce przez 30 sekund. Papierowe plamy zostaną umieszczone w rurce mikrofonowej zawierającej roztwór Tris-Edta. Wszystkie próbki zostaną natychmiast zamrożone i przechowywane w temperaturze -20 ° C do analizy laboratoryjnej. Próbki biofilmu zostaną usunięte z pasków papierowych, dodając 200 µl soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i wirowania przez 1 minutę. Papier zostanie usunięty, a DNA izolowany za pomocą zestawu Qiagen Miniamp (Valencia, Kalifornia) zgodnie z zaleceniami producenta. Doustna profilaktyka lub niechirurgiczne leczenie przyzębia nie będą inicjowane przed pobraniem próbek, a osoby będą zapisać się do programu leczenia przyzębia w razie potrzeby.

   Sekwencjonowanie DNA i analiza danych: Hiperwarialny region V3-V4 genu 16S rRNA zostanie wzmocniony przy użyciu starterów i warunków PCR opisanych wcześniej Klindworth i in. (2013). Zgodnie z zaleceniem producenta oczyszczanie PCR zostanie przeprowadzone przy użyciu perełek magnetycznych (Ampure XP Bead, Beckman Agencourt) w stosunku 0,8 koralików/objętości PCR. Po podtrzymaniu adapterów zostanie przeprowadzone nowe oczyszczenie PCR przy użyciu koralików magnetycznych (ampure XP, Beckman Agencourt) w stosunku 1,12 perełek/objętości PCR. Normalizacja biblioteki zostanie przeprowadzona przy użyciu zestawu płytki normalizacji SequalPrep ™ (96) (Applied Biosystems ™), a połączona biblioteka zostanie określona ilościowo. Stężenia DNA równomolowego zostaną połączone i zsekwencjonowane na platformie Illumina Miseq w celu wytworzenia sekwencji sparowanych na 300 pz. Analiza bioinformatyczna zostanie przeprowadzona przy użyciu QIIME 2 2020.6 (Bolyen i in., 2019). Demultipleksowane pliki FASTQ zostaną uzyskane z obiektu sekwencjonowania, a Q2 Cutadapt (Martin, 2011) zostaną użyte do usuwania starterów przed procesem Denoising, który zostanie wykonany z Q2-DADA2 (Callahan i in., 2016). Do wyrównania wszystkich wariantów sekwencji amplikonu (ASVS) z MAFFT (Katoh i in., 2002) i do skonstruowania filogenezy z FastTree2 (Price i FastTree2 (Price i FastTree2 (Price i FastTree2 (Price i FastTree2 (Price i in., 2010) i do skonstruowania filogenezy z FastTree2 (Price i in., 2010) zostanie wykorzystany do wyrównania fastree2 (Price i in., 2010). Taksonomia zostanie przypisana do ASV przy użyciu naiwnego klasyfikatora taksonomii Bayesa klasyfikatora Q2-Feature (Bokulich i in. 2018a) przeszkolonych przeciwko rozszerzonej bazie danych mikrobiomu doustnego ludzkiego (EHOMD, V15.2) (Escapa i in., 2018). Wskaźniki różnorodności alfa (Shannon (Spellerberg, 2003)), wskaźniki beta-różnorodności (ważone uniFRAC (Lozupone i in. 2007), nieważona uniFRAC (Lozupone i in. 2005), a analiza głównych współrzędnych (PCOA) zostaną oszacowane przy użyciu rdzeniowo-rozdzielczości Q2-rozdzielczości po próbkach rozerwalnych do 10591 do 10591. sekwencje na próbkę. Różnice w różnorodności alfa (różnice w próbkach) będą mierzone za pomocą różnic par (Bokulich i in. 2018b). W przypadku różnorodności beta (różnice między próbkami) różnice między grupami będą mierzone za pomocą testów Permanova i Pertisp (Q2-Riversity). Mikrobiom rdzeniowy (biorąc pod uwagę mikrobiom rdzeniowy jako gatunki obecne w co najmniej 50% próbek w grupie) zostanie obliczone przy użyciu cech podstawowych z tabeli gatunku na poziomie gatunku F-Feature. Wizualizacja zostanie przeprowadzona przy użyciu mapy cieplnej stołowej Q2 (w celu wizualizacji względnej liczebności gatunków) i filotoast (Dabdoub i in., 2016). Różnicowa liczebność między gatunkami zostanie obliczona za pomocą ANCOM-BC (Lin i Peddada, 2020).

6. Analiza zapalna: Implant płyn szczelinowy i tkanka ziarnina z oczyszczania zostaną zebrane ze wszystkich osób zaangażowanych w badanie, w miejscach leczonych zapaleniem okołoplanowania. Podczas zbierania materiału przedmiotowe miejsce będzie odpowiednio izolowane i wysuszone za pomocą sterylizowanych bułek bawełnianych. Biofilm nadrzędny zostanie usunięty, a próbki płynu dziąseł zostaną uzyskane przez wstawienie punktów papieru między zębem a interfejsem tkanki przyzębia przez 30 sekund (Casarin i in. 2010). Dwa punkty papierowe zostaną wykorzystane na miejsce w celu uzyskania odpowiedniej objętości płynu szczelinowego. Objętość zebranego płynu będzie mierzona za pomocą periotronu (Periotron 8000, ProLow Inc., Amityville, NY, USA), a plamy papierowe zostaną następnie umieszczone w rurkach mikrofonowych (Eppendorf), zakodowanych dla każdego i eksperymentalnego okresu z 150 µl roztworu bufora fosforanowego (PBS) i 0,05% Teween-20. Tkanka granulacyjna usunięta podczas skrobania implantu będzie przechowywana w Rnalater i zamrożona w temperaturze -80C. Próbki zostaną przechowywane do późniejszej analizy. Przed analizą próbki zostaną rozcieńczone w 60 µl buforu z zestawu Millipore, wirujące przez 30 minut, a następnie wirowane przez 10 minut przy 10 000 obr / min. Próbki każdego płynu dziąseł zostaną przeanalizowane dla IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17, TNFα i IFN-Δ za pomocą technologii Luminex/Magpix, która nie tylko określa obecność, ale będzie określać kwantyfikację w bezwzględnych warunkach. W skrócie, próbki zostaną rozcieńczone w buforze PBS + 5% Tween, a wiruje przez 30 sekund przed analizą. Po delikatnym odwirowaniu 25 µl supernatantu zostanie umieszczone w 96-studzienkowych płytkach wraz z perełkami dla każdej cytokiny/proteazy. Po inkubacji z koralikami zostaną zapewnione wtórne przeciwciała i podłoże, a płytki zostaną odczytane za pomocą platformy Magpix. Stężenie każdego analitu zostanie wyrażone w PG/µL. Próbki o kwantyfikacji poniżej granicy wykrywania analizy zostaną zarejestrowane jako „zero”, a próbki powyżej granicy kwantyfikacji krzywej standardowej zostaną zarejestrowane o wartości równej najwyższej wartości krzywej.
7. Analiza statystyczna: - Analizy statystyczne zostaną przeprowadzone w celu porównania parametrów klinicznych, składu mikrobiomu i ekspresji cytokin między grupami przez cały okres obserwacji. - Różnica w skuteczności między dwiema procedurami zostanie oceniona.

Wszystkie analizy tych badań zostaną przeprowadzone w laboratoriach badawczych w obszarze Periodontics w Piracicaba School of Dentistry.