Valutazione dell'implantoplastica nel trattamento della perimplantite.

1. Partecipanti: i pazienti adulti diagnosticati con perimplantite (Caton et al. 2018, Papapanou et al. 2018) saranno inclusi; I pazienti saranno reclutati dalla popolazione studiata nello studio caso-controllo di cui sopra, a cui è stata diagnosticata la perimplantite; I criteri di inclusione ed esclusione seguiranno i criteri precedentemente definiti nello studio caso-controllo.
2. Allocazione dei partecipanti: i partecipanti verranno assegnati in modo casuale in due gruppi: gruppo 1 (implantoplastica) e gruppo 2 (accesso chirurgico). - L'allocazione verrà eseguita da un sistema di randomizzazione computerizzato (SEILED ENVELOPE.com).
3. Procedure cliniche: Gruppo 1 (implantoplastica): gli impianti interessati subiranno implantoplastica, coinvolgendo il rimodellamento della superficie dell'impianto per facilitare la pulizia e rimuovere le aree compromesse. Gruppo 2 (accesso chirurgico): gli impianti colpiti saranno trattati attraverso l'accesso chirurgico, con rimozione meccanica del tessuto infiammato e pulizia della superficie dell'impianto.
4. Valutazione clinica: i parametri clinici iniziali verranno registrati prima della procedura e ad intervalli specifici (1, 3 e 6 mesi dopo la procedura); Gli indici parodontali e per-impianti, incluso l'indice della placca, il sanguinamento al sondaggio, la profondità di sondaggio e il livello di attaccamento clinico, saranno valutati da un esaminatore calibrato.

5. Raccolta e analisi del biofilm (microbioma): i campioni di biofilm parodontale e perimpianto saranno raccolti per l'analisi tassonomica. Tutti i campioni saranno ottenuti prima dell'esame parodontale. Prima della raccolta di biofilm subginival/sottomucosa, il biofilm supragingival/supramucosale verrà attentamente rimosso usando curette sterili. Il sito sarà isolato usando rotoli di cotone e essiccato delicatamente con una siringa d'aria per evitare la contaminazione con la saliva. I campioni di biofilm saranno ottenuti mediante punti di carta da filtro standard dalle superfici buccali dei denti/impianti. I punti della carta da filtro verranno inseriti nel solco gengivale/per-impianto e lasciati in posizione per 30 secondi. Le macchie di carta verranno posizionate in una provetta per microcentrifuga contenente soluzione Tris-EDTA. Tutti i campioni verranno immediatamente congelati e conservati a -20 ° C fino all'analisi di laboratorio. I campioni di biofilm verranno rimossi dalle strisce di carta aggiungendo 200 µL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e vortice per 1 minuto. Il punto cartaceo verrà rimosso e il DNA isolato usando il kit Qiagen MiniaMp (Valencia, CA) seguendo le raccomandazioni del produttore. La profilassi orale o il trattamento parodontale non chirurgico non saranno avviati prima della raccolta del campione e i soggetti saranno iscritti a un programma di trattamento parodontale, se necessario.

   Sequenziamento del DNA e analisi dei dati: la regione ipervariabile V3-V4 del gene rRNA 16S verrà amplificata usando i primer e le condizioni PCR precedentemente descritte da Klindworth et al. (2013). Secondo la raccomandazione del produttore, la purificazione della PCR verrà eseguita utilizzando perle magnetiche (tallone Ampure XP, Beckman Agencourt) con un rapporto di 0,8 perle/volume PCR. Dopo la legatura degli adattatori, verrà eseguita una nuova purificazione della PCR utilizzando perle magnetiche (tallone Ampure XP, Beckman Agencourt) con un rapporto di 1,12 perle/volume PCR. La normalizzazione della libreria verrà eseguita utilizzando il kit di piastre di normalizzazione SequelPrep ™ (96) (Applied Biosystems ™) e la libreria combinata verrà quantificata. Le concentrazioni di DNA equimolare saranno raggruppate e sequenziate sulla piattaforma Illumina MISEQ per produrre sequenze di fascia abbinata da 300 bp. L'analisi bioinformatica verrà eseguita utilizzando Qiime 2 2020.6 (Bolyen et al., 2019). I file FastQ demultiplexed saranno ottenuti dalla struttura di sequenziamento e Q2 Cutadapt (Martin, 2011) verrà utilizzato per rimuovere i primer prima del processo di denoising, che verrà eseguito con Q2-Dada2 (Callahan et al., 2016). La pipeline MAFFT-Fasttree (Q2-Philogenie) allinea-to-tree verrà utilizzata per allineare tutte le varianti di sequenza di ampliconi (ASV) con MAFFT (Katoh et al., 2002) e per costruire una filogenesi con FastTree2 (Price et al., 2010). La tassonomia sarà assegnata ad ASVS utilizzando l'ingenuo classificatore di tassonomia Bayes Classificatore-Classificatore (Bokulich et al. 2018a) addestrato contro il database di microbioma orale umano ampliato (EHOMD, V15.2) (Escapa et al., 2018). Alpha-diversity metrics (Shannon (Spellerberg, 2003)), beta-diversity metrics (weighted UniFrac (Lozupone et al. 2007), unweighted UniFrac (Lozupone et al. 2005)), and Principal Coordinates Analysis (PCoA) will be estimated using the q2-diversity core-metrics-phylogenetic pipeline after samples are rarefied to 10591 sequenze per campione. Le differenze nella diversità alfa (differenze all'interno dei campioni) saranno misurate usando differenze a coppie (Bokulich et al. 2018b). Per la diversità beta (differenze tra i campioni), le differenze tra i gruppi verranno misurate utilizzando i test permanente e permdisp (Q2-diversity). Il microbioma core (considerando il microbioma centrale come specie presenti in almeno il 50% dei campioni in un gruppo) sarà calcolato usando le caratteristiche fondamentali della tabella a livello di specie Q2-Feature. La visualizzazione verrà eseguita utilizzando la mappa di calore della tavola Q2 (per visualizzare l'abbondanza relativa delle specie) e il phylotoast (Dabdoub et al., 2016). L'abbondanza differenziale tra le specie verrà calcolata usando ANCOM-BC (Lin & Peddada, 2020).

6. Analisi infiammatoria: il fluido crevicolare perimpianto e il tessuto di granulazione dal debridement saranno raccolti da tutti gli individui coinvolti nello studio, in siti trattati con perimplantite. Durante la raccolta del materiale, il sito in questione sarà adeguatamente isolato e essiccato con rotoli di cotone sterilizzati. Il biofilm supragaging verrà rimosso e campioni di fluido gengivale saranno ottenuti inserendo punti di carta tra il dente e l'interfaccia del tessuto parodontale per 30 secondi (Casarin et al. 2010). Verranno utilizzati due punti di carta per sito per ottenere un volume adeguato di fluido crevicolare. Il volume del fluido raccolto verrà misurato con il periotron (Perotitron 8000, Proflow Inc., Amityville, NY, USA) e i punti di carta saranno quindi collocati in tubi a microcentrifuga (Eppendorf), codificati per ogni singolo e periodi sperimentali con 150 µl di soluzione di tampone fosfato (PBS) e 0,05% di Tween-20. Il tessuto di granulazione rimosso durante la raschiatura dell'impianto sarà immagazzinato in rnalter e congelato a -80 ° C. I campioni verranno archiviati per l'analisi successiva. Prima dell'analisi, i campioni verranno diluiti in 60 µL di tampone dal kit Millipore, vortice per 30 minuti e quindi centrifugati per 10 minuti a 10.000 giri / min. I campioni di ciascun fluido gengivale verranno analizzati per IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17, TNFα e IFN-Δ dalla tecnologia Luminex/Magpix, che non solo determinerà la presenza, ma quantificherà in termini assoluti la concentrazione di diversi marcatori nello stesso campione, usando i kit commercialmente disponibili, seguendo le istruzioni del produttore. In breve, i campioni saranno diluiti in tampone PBS + 5% e vortice per 30 secondi, prima dell'analisi. Dopo delicata centrifugazione, 25 µl di surnatante verranno collocati in piastre da 96 pozzetti insieme alle perle immunolabeline specifiche per ciascuna citochina/proteasi. Dopo l'incubazione con le perle, verranno forniti anticorpi secondari e substrato e le piastre verranno lette utilizzando la piattaforma Magpix. La concentrazione di ciascun analita sarà espressa in PG/µL. I campioni con quantificazione al di sotto del limite di rilevamento dell'analisi verranno registrati come "zero" e i campioni al di sopra del limite di quantificazione della curva standard verranno registrati con un valore pari al valore più alto della curva.
7. Analisi statistica: - Verranno eseguite analisi statistiche per confrontare i parametri clinici, la composizione del microbioma e l'espressione delle citochine tra i gruppi durante il periodo di follow -up. - Verrà valutata la differenza di efficacia tra le due procedure.

Tutte le analisi di questa ricerca saranno eseguite nei laboratori di ricerca dell'area parodontica della Piracicaba School of Dentistry.