Avaliação da implantoplastia no tratamento da peri-implantite.

1. Participantes: pacientes adultos diagnosticados com peri-implantite (Caton et al. 2018, Papapanou et al. 2018) serão incluídos; Os pacientes serão recrutados da população estudada no estudo de caso-controle acima mencionado, diagnosticado com peri-implantite; Os critérios de inclusão e exclusão seguirão os critérios definidos anteriormente no estudo de caso-controle.
2. Alocação dos participantes: Os participantes serão alocados aleatoriamente em dois grupos: Grupo 1 (implantoplastia) e Grupo 2 (acesso cirúrgico). - A alocação será realizada por um sistema de randomização computadorizado (envelope.com).
3. Procedimentos clínicos: Grupo 1 (implantoplastia): Os implantes afetados serão submetidos a implantoplastia, envolvendo a remodelação da superfície do implante para facilitar a limpeza e remover áreas comprometidas. Grupo 2 (Acesso Cirúrgico): Os implantes afetados serão tratados através do acesso cirúrgico, com a remoção mecânica do tecido inflamado e a limpeza da superfície do implante.
4. Avaliação clínica: Os parâmetros clínicos iniciais serão registrados antes do procedimento e em intervalos específicos (1, 3 e 6 meses após o procedimento); Os índices periodontais e peri-implantes, incluindo índice de placa, sangramento na investigação, profundidade de sondagem e nível de fixação clínica, serão avaliados por um examinador calibrado.

5. Coleção e análise de biofilme (microbioma): As amostras de biofilme periodontal e peri-implante serão coletadas para análise taxonômica. Todas as amostras serão obtidas antes do exame periodontal. Antes da coleção de biofilme subgingival/submucosa, o biofilme supramucoso/supramucoso será cuidadosamente removido usando curetes estéreis. O local será isolado usando rolos de algodão e seco suavemente com uma seringa de ar para evitar a contaminação com a saliva. As amostras de biofilme serão obtidas por pontos de papel de filtro padrão das superfícies bucais dos dentes/implantes. Os pontos de papel do filtro serão inseridos no sulco gengival/peri-implante e deixados no lugar por 30 segundos. As manchas em papel serão colocadas em um tubo de microcentrífuga contendo solução Tris-EDTA. Todas as amostras serão imediatamente congeladas e armazenadas a -20 ° C até a análise de laboratório. As amostras de biofilme serão removidas das tiras de papel adicionando 200 µl de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e vórtex por 1 minuto. O ponto de papel será removido e o DNA isolado usando o kit Qiagen Miniamp (Valencia, CA) seguindo as recomendações do fabricante. A profilaxia oral ou tratamento periodontal não cirúrgico não será iniciado antes da coleta de amostras, e os indivíduos serão inscritos em um programa de tratamento periodontal, conforme necessário.

   Sequenciamento de DNA e análise de dados: A região hipervariável V3-V4 do gene 16S rRNA será amplificada usando os iniciadores e as condições de PCR descritos anteriormente por Klindworth et al. (2013). De acordo com a recomendação do fabricante, a purificação de PCR será realizada usando contas magnéticas (BEAD AMPURE XP, BECKMAN AGENCOURT) a uma proporção de 0,8 contas/volume de PCR. Após a ligação dos adaptadores, uma nova purificação de PCR será realizada usando contas magnéticas (BEAD AMPURE XP, BECKMAN AGENCOURT) com uma proporção de volume de 1,12 contas/PCR. A normalização da biblioteca será realizada usando o kit de placa de normalização do sequ -prep ™ (96) (Applied Biosystems ™) e a biblioteca combinada será quantificada. As concentrações equimolares de DNA serão agrupadas e sequenciadas na plataforma Illumina MiSeq para produzir sequências de extremidade pareada de 300 pb. A análise bioinformática será realizada usando o QIIME 2 2020.6 (Bolyen et al., 2019). Os arquivos FASTQ desmultiplexados serão obtidos na instalação de seqüenciamento, e o Q2 Cutadapt (Martin, 2011) será usado para remover os iniciadores antes do processo de denoising, que será realizado com Q2-DADA2 (Callahan et al., 2016). O pipeline de alinhamento para árvore Mafft-Fasttree (Q2-filogenia) será usado para alinhar todas as variantes de sequência de amplicons (ASVs) com Mafft (Katoh et al., 2002) e construir uma filogenia com fasttree2 (Price et al., 2010). A taxonomia será atribuída ao ASVS usando o classificador de taxonomia ingênuo Bayes Q2-F-Feature-Classifier (Bokulich et al. 2018a) treinados contra o expandido banco de dados de microbioma oral humano (EHOMD, v15.2) (Escapa et al., 2018). Métricas de diversidade de alfa (Shannon (Spellerberg, 2003)), métricas de diversidade beta (unifrac ponderado (Lozupone et al. 2007), Unifrac não ponderado (Lozupone et al. 2005), e a análise de coordenados principais (pPOA) será estimada usando o Q2-the Q2-the Distanity Sequências por amostra. As diferenças na diversidade alfa (diferenças nas amostras) serão medidas usando diferenças pareadas (Bokulich et al. 2018b). Para a diversidade beta (diferenças entre amostras), as diferenças entre os grupos serão medidas usando testes de permaneva e permdisp (diversidade Q2). O microbioma do núcleo (considerando o microbioma do núcleo como espécies presentes em pelo menos 50% das amostras em um grupo) será calculado usando as características do núcleo da tabela de nível de espécie de tabela de featuras Q2. A visualização será realizada usando o mapa de calor da tabela de fumo Q2 (para visualizar a abundância relativa de espécies) e filotoast (Dabdoub et al., 2016). A abundância diferencial entre as espécies será calculada usando ANCOM-BC (LIN & PEDDADA, 2020).

6. Análise inflamatória: O líquido intermediário peri-implante e o tecido de granulação do desbridamento serão coletados de todos os indivíduos envolvidos no estudo, em locais tratados com peri-implantite. Durante a coleta do material, o local em questão será adequadamente isolado e seco com rolos de algodão esterilizados. O biofilme supragingival será removido e as amostras de fluido gengival serão obtidas inserindo pontos de papel entre o dente e a interface do tecido periodontal por 30 segundos (Casarin et al. 2010). Dois pontos de papel serão usados ​​por local para obter um volume adequado de líquido crocador. O volume de líquido coletado será medido com o periotron (periotron 8000, Proflow Inc., Amityville, NY, EUA) e os manchas em papel serão colocados em tubos de microcentrífuga (eppendorf), codificados para cada um dos períodos individuais e experimentais com soluções de túnica de 150 µl de fosfato. O tecido de granulação removido durante a raspagem do implante será armazenado em rnalater e congelado a -80 ° C. As amostras serão armazenadas para análise posterior. Antes da análise, as amostras serão diluídas em 60 µl de tampão do kit Millipore, agitadas por 30 minutos e depois centrifugadas por 10 minutos a 10.000 rpm. As amostras de cada fluido gengival serão analisadas para IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17, TNFα e IFN-δ por Luminex/MagPix, que não apenas determinarão a presença, mas quantificarão em termos absolutos dos diferentes marcadores na amostra. Resumidamente, as amostras serão diluídas em tampão PBS + 5% de interpolação e vórtex por 30 segundos, antes da análise. Após centrifugação suave, 25 µl de sobrenadante serão colocados em placas de 96 poços juntamente com as esferas imunolabeladas específicas para cada citocina/protease. Após a incubação com as contas, serão fornecidos anticorpos secundários e substrato e as placas serão lidas usando a plataforma Magpix. A concentração de cada analito será expressa em PG/µL. As amostras com quantificação abaixo do limite de detecção da análise serão registradas como "zero", e as amostras acima do limite de quantificação da curva padrão serão registradas com um valor igual ao valor mais alto da curva.
7. Análise Estatística: - As análises estatísticas serão realizadas para comparar parâmetros clínicos, composição do microbioma e expressão de citocinas entre os grupos durante o período de acompanhamento. - A diferença na eficácia entre os dois procedimentos será avaliada.

Todas as análises desta pesquisa serão realizadas nos laboratórios de pesquisa da área de periodontia da Escola de Odontologia Piracicaba.