Implantoplastian arviointi peri-implantiitin hoidossa.

1. Osallistujat: Aikuispotilaat, joilla on diagnosoitu peri-implantiitti (Caton ym. 2018, Papapanou ym. 2018), otetaan mukaan; Potilaat rekrytoidaan edellä mainitussa tapausvalvontatutkimuksessa tutkitusta populaatiosta, joille on diagnosoitu peri-implantiitti; Sisällyttämis- ja poissulkemiskriteerit noudattavat aiemmin tapauskontrollitutkimuksessa määriteltyjä kriteerejä.
2. Osallistujien allokointi: Osallistujat jaetaan satunnaisesti kahteen ryhmään: ryhmään 1 (implantoplastia) ja ryhmä 2 (kirurginen pääsy). - Allokaatio suoritetaan tietokoneisteollisella satunnaistamisjärjestelmällä (sinetöity vaippa.com).
3. Kliiniset toimenpiteet: Ryhmä 1 (implantoplastia): Vaikuttavat implantit läpikäyvät implantoplastian, johon sisältyy implantin pinnan uusinta puhdistuksen helpottamiseksi ja vaarantuneiden alueiden poistamiseksi. Ryhmä 2 (kirurginen pääsy): Vaikuttavat implantit hoidetaan kirurgisella pääsyllä, ja tulehtuneen kudoksen mekaanisella poistolla ja implantin pinnan puhdistamisella.
4. Kliininen arviointi: Alkuperäiset kliiniset parametrit tallennetaan ennen toimenpidettä ja tietyin väliajoin (1, 3 ja 6 kuukautta toimenpiteen jälkeen); Periodontaaliset ja peri-implantti-indeksit, mukaan lukien plakkiindeksi, verenvuoto koettelemisessa, koettomuuden syvyys ja kliininen kiinnitystaso, arvioidaan kalibroidulla tarkastajalla.

5. Biofilmi (mikrobiomi) keräys ja analyysi: periodontaaliset ja peri-implantin biofilminäytteet kerätään taksonomista analyysiä varten. Kaikki näytteet saadaan ennen periodontaalista tutkimusta. Ennen subgingival/submukoosisen biofilmin kokoelmaa, supragingval/supramucosaalisen biofilmi poistetaan huolellisesti steriilillä kurketeilla. Sivusto eristetään puuvillarullalla ja kuivataan varovasti ilmaruiskulla syljen saastumisen välttämiseksi. Biofilminäytteet saadaan vakiosuodatinpaperipisteillä hampaiden/implanttien bukcal -pinnoista. Suodatinpaperipisteet asetetaan ikenen/peri-implantin sulcukseen ja jätetään paikoilleen 30 sekunnin ajan. Paperipisteet asetetaan mikrosentrifugiputkeen, joka sisältää Tris-Edta-liuosta. Kaikki näytteet jäädytetään välittömästi ja varastoidaan -20 ° C: seen laboratorioanalyysiin saakka. Biofilminäytteet poistetaan paperinauhoista lisäämällä 200 ui fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS) ja pyörremällä 1 minuutin ajan. Paperipiste poistetaan ja DNA eristetään käyttämällä Qiagen Miniamp -sarjaa (Valencia, CA) valmistajan suositusten mukaisesti. Suun kautta tapahtuvaa ennaltaehkäisyä tai ei -kirurgista periodontaalista hoitoa ei käynnistetä ennen näytteen keräämistä, ja koehenkilöt ilmoittautuvat tarvittaessa periodontaaliseen hoito -ohjelmaan.

   DNA-sekvensointi ja data-analyysi: 16S-rRNA-geenin V3-V4-hypervariate-alue monistetaan käyttämällä alukkeita ja PCR-olosuhteita, jotka ovat aiemmin kuvanneet Klindworth et ai. (2013). Valmistajan suosituksen mukaan PCR -puhdistus suoritetaan käyttämällä magneettihelmiä (AmpRe XP -helmi, Beckman Agencourt) suhteessa 0,8 helmiä/PCR -tilavuutta. Adapterien ligaation jälkeen uusi PCR -puhdistus suoritetaan käyttämällä magneettihelmiä (AmpRe XP -helmi, Beckman Agencourt) suhteessa 1,12 helmiä/PCR -määrää. Kirjaston normalisointi suoritetaan käyttämällä SequalPREP ™ -normalisointikilpailua (96) (Applied Biosystems ™), ja yhdistetty kirjasto kvantifioidaan. Equimololaariset DNA-pitoisuudet yhdistetään ja sekvensoidaan Illumina Miseq -alustalle 300 bp: n parillisen pään sekvenssien tuottamiseksi. Bioinformaattinen analyysi suoritetaan käyttämällä QIIME 2 2020.6 (Bolyen et ai., 2019). Demultipleksoituja FastQ-tiedostoja saadaan sekvensointilaitoksesta, ja Q2 Cuuladapt (Martin, 2011) käytetään alukkeiden poistamiseen ennen denoisointiprosessia, joka suoritetaan Q2-Dada2: lla (Callahan et al., 2016). Kaikkien Amplicon-sekvenssivarianttien (ASV) kohdistamiseen MAFFT: n (Katoh et ai., 2002) ja fylogenian kanssa Fasttree2: n kanssa (Price et ai., 2010). Taksonomia jaetaan ASV: lle käyttämällä naiiveja Bayes-taksonomian luokittelijaa Q2-Feature-luokka (Bokulich ym. 2018a), joka on koulutettu laajennettuun ihmisen suun mikrobiomitietokantaan (Ehomd, V15.2) (Escapa ym., 2018). Alfa-monimuotoisten mittareiden (Shannon (Spellerberg, 2003)), beeta-monimuotoisuusmittarit (painotettu UNIFRAC (Lozupone ym. 2007), painottamaton UNIFRAC (Lozupone ym. 2005)) ja pääkoordinaattien analyysi (PCOA) arvioidaan Q2-diversiteetin ydin-metrien ja fylogenettisen putken jälkeen, jotka ovat Rarefed 10591: n. sekvenssit näytettä kohti. Erot alfa -monimuotoisuudessa (näytteiden erot) mitataan pareittain eroilla (Bokulich ym. 2018b). Beeta-monimuotoisuuden (näytteiden väliset erot) osalta ryhmien välillä mitataan eroja käyttämällä PNATEOVA- ja PermDISP (Q2-diversiteetti) -testejä. Ydinmikrobiomi (ottaen huomioon ytimen mikrobiomi lajeina, jotka ovat läsnä vähintään 50%: lla ryhmän näytteistä) lasketaan käyttämällä Q2-oma-taulukon lajien taulukon ydinominaisuuksia. Visualisointi suoritetaan käyttämällä Q2-omaista taulukon lämpökarttaa (lajien suhteellisen runsauden visualisoimiseksi) ja fylotoast (Dabdoub et ai., 2016). Lajien välinen differentiaalinen runsaus lasketaan käyttämällä Ancom-BC: tä (Lin & Peddada, 2020).

6. Tulehduksellinen analyysi: Krevisulaarinen neste ja rakeistuksen kudokset kerätään kaikilta tutkimukseen osallistuvilta yksilöiltä, ​​jotka on käsitelty peri-implantiitissa. Materiaalin keräämisen aikana kyseinen alue eristetään oikein ja kuivataan steriloiduilla puuvillateloilla. Supragingvalbiofilmi poistetaan ja näytteet ikenenesteestä saadaan asettamalla paperipisteet hampaan ja periodontaalisen kudosrajapinnan väliin 30 sekunnin ajan (Casarin et al. 2010). Kohtaa kohti käytetään kahta paperipistettä riittävän määrän saamiseksi krevikulaarista nestettä. Kerätyn nesteen tilavuus mitataan periotronilla (Periotron 8000, Proflow Inc., Amityville, NY, USA) ja paperipaikat asetetaan sitten mikrosentrifugiputkiin (Eppendorf), koodattu jokaiselle yksittäiselle ja kokeelliselle ajanjaksolle 150 µL fosfaattipuskuriliuoksella (PBS) ja 0,05% Tween-20: lla. Implantin raapimisen aikana poistettu rakeistuskudos säilytetään RNALATERissa ja jäädytetään -80 ° C: ssa. Näytteet tallennetaan myöhempää analyysiä varten. Ennen analyysiä näytteet laimennetaan 60 ui puskurina Millipore -sarjasta, pyörrettynä 30 minuutin ajan ja sentrifugoitiin sitten 10 minuutin ajan nopeudella 10 000 rpm. Kunkin ikenen nesteen näytteitä analysoidaan IL-1β: lle, IL-4: lle, IL-6: lle, IL-8: lle, IL-10: lle, IL-17: lle, TNFa: lle ja IFN-δ: lle LUNINEX/MAGPIX-tekniikalla, mikä ei vain määrittele läsnäoloa, vaan myös kvantifioida absoluuttisesti eri merkinnöiden pitoisuus samassa näytteessä, kaupallisesti saatavissa olevien ketterien avulla. Lyhyesti, näytteet laimennetaan PBS -puskurissa + 5% Tween ja pyörre 30 sekunnin ajan ennen analyysiä. Hellävaraisen sentrifugoinnin jälkeen 25 ui supernatanttia asetetaan 96-kuoppalevyiksi yhdessä jokaiselle sytokiinille/proteaasille spesifisten immunoliiteisten helmien kanssa. Helmien kanssa inkuboinnin jälkeen toimitetaan sekundaariset vasta -aineet ja substraatti ja levyt luetaan Magpix -alustalla. Kunkin analyytin konsentraatio ekspressoituu pg/µL: ssä. Näytteet, joiden kvantifiointi on alle analyysin havaitsemisrajan, tallennetaan "nollaksi", ja näytteet standardikäyrän kvantifiointirajan yläpuolella tallennetaan arvolla, joka on yhtä suuri kuin käyrän korkein arvo.
7. Tilastollinen analyysi: - Tilastolliset analyysit suoritetaan kliinisten parametrien, mikrobiomin koostumuksen ja sytokiinien ekspression vertaamiseksi ryhmien välillä koko seurantajakson ajan. - Kahden menettelyn välisen tehokkuuden ero arvioidaan.

Kaikki tämän tutkimuksen analyysit suoritetaan Piracicaban hammaslääketieteen korkeakoulun periodontiikan alueen tutkimuslaboratorioissa.