Evaluering af implantoplastik til behandling af peri-implantitis.

1. Deltagere: Voksne patienter, der er diagnosticeret med peri-implantitis (Caton et al. 2018, Papapanou et al. 2018) vil blive inkluderet; Patienter vil blive rekrutteret fra den befolkning, der blev undersøgt i den førnævnte case-control-undersøgelse, der blev diagnosticeret med peri-implantitis; Inkluderings- og ekskluderingskriterier vil følge kriterierne, der tidligere var defineret i case-control-undersøgelsen.
2. Deltagerallokering: Deltagerne tildeles tilfældigt i to grupper: gruppe 1 (implantoplastik) og gruppe 2 (kirurgisk adgang). - Tildeling udføres af et edb -randomiseringssystem (Sealed Convolut.com).
3. Kliniske procedurer: gruppe 1 (implantoplastik): De berørte implantater vil gennemgå implantoplastik, der involverer ombygningen af ​​implantatoverfladen for at lette rengøring og fjerne kompromitterede områder. Gruppe 2 (kirurgisk adgang): De berørte implantater behandles gennem kirurgisk adgang med mekanisk fjernelse af det betændte væv og rengøring af implantatoverfladen.
4. Klinisk evaluering: indledende kliniske parametre registreres inden proceduren og med specifikke intervaller (1, 3 og 6 måneder efter proceduren); Periodontale og peri-implantatindekser, inklusive plakindeks, blødning på sondering, sonderingsdybde og klinisk tilknytningsniveau, evalueres af en kalibreret eksaminator.

5. Biofilm (mikrobiome) samling og analyse: Periodontal og peri-implantat biofilmprøver indsamles til taksonomisk analyse. Alle prøver opnås inden den periodontale undersøgelse. Før subgingival/submucosal biofilm -samling fjernes supragingival/supramucosal biofilm omhyggeligt ved hjælp af sterile curettes. Webstedet vil blive isoleret ved hjælp af bomuldsruller og tørret forsigtigt med en luftsprøjte for at undgå forurening med spyt. Biofilmprøver opnås ved standardfilterpapirpunkter fra de bukkale overflader på tænderne/implantaterne. Filterpapirpunkterne indsættes i gingival/peri-implantat sulcus og efterlades på plads i 30 sekunder. Papirsteder placeres i et mikrocentrifuge-rør indeholdende Tris-EDTA-opløsning. Alle prøver fryses og opbevares straks ved -20 ° C indtil laboratorieanalyse. Biofilmprøver fjernes fra papirstrimlerne ved at tilsætte 200 µl phosphatbufferet saltvand (PBS) og hvirvel i 1 minut. Papirpladsen fjernes og DNA isoleret ved hjælp af Qiagen Miniamp -kittet (Valencia, CA) efter producentens anbefalinger. Oral profylakse eller ikke -kirurgisk periodontal behandling vil ikke blive initieret før prøveopsamling, og forsøgspersoner vil blive tilmeldt et periodontalt behandlingsprogram efter behov.

   DNA-sekventering og dataanalyse: V3-V4-hypervariable regionen af ​​16S rRNA-genet vil blive amplificeret under anvendelse af primere og PCR-betingelser, der tidligere er beskrevet af Klindworth et al. (2013). I henhold til producentens anbefaling udføres PCR -rensning ved hjælp af magnetiske perler (Ampure XP perle, Beckman Agencourt) i et forhold på 0,8 perler/PCR -volumen. Efter ligering af adaptere udføres en ny PCR -rensning ved hjælp af magnetiske perler (Ampure XP perle, Beckman Agencourt) i et forhold på 1,12 perler/PCR -volumen. Biblioteknormalisering udføres ved hjælp af SequalPrep ™ Normalization Plate Kit (96) (Applied Biosystems ™), og det kombinerede bibliotek kvantificeres. Equimolære DNA-koncentrationer samles og sekventeres på Illumina Miseq-platformen for at producere 300 bp parrede ende sekvenser. Bioinformatisk analyse udføres ved hjælp af Qiime 2 2020.6 (Bolyen et al., 2019). Demultiplexed FASTQ-filer opnås fra sekventeringsfaciliteten, og Q2 Cutadapt (Martin, 2011) vil blive brugt til at fjerne primere inden denoising-processen, som vil blive udført med Q2-DADA2 (Callahan et al., 2016). Den align-til-træ MAFFT-FASTTREE (Q2-Phylogeny) rørledning vil blive brugt til at justere alle Amplicon-sekvensvarianter (ASV'er) med MAFFT (Katoh et al., 2002) og til at konstruere en phylogeny med FastTree2 (Price et al., 2010). Taxonomi tildeles ASV'er ved hjælp af Naive Bayes Taxonomy Classifier Q2-Featur-klassificering (Bokulich et al. 2018a) trænet mod den udvidede humane orale mikrobiomdatabase (EHOMD, V15.2) (Escapa et al., 2018). Alpha-diversity metrics (Shannon (Spellerberg, 2003)), beta-diversity metrics (weighted UniFrac (Lozupone et al. 2007), unweighted UniFrac (Lozupone et al. 2005)), and Principal Coordinates Analysis (PCoA) will be estimated using the q2-diversity core-metrics-phylogenetic pipeline after samples are rarefied til 10591 sekvenser pr. Prøve. Forskelle i alfa -mangfoldighed (forskelle inden for prøver) måles ved hjælp af parvise forskelle (Bokulich et al. 2018b). For beta-mangfoldighed (forskelle mellem prøver) måles forskelle mellem grupper ved hjælp af Permanova og PerMDISP (Q2-Diversity) -test. Kernemikrobiomet (i betragtning af det centrale mikrobiom som arter, der er til stede i mindst 50% af prøverne i en gruppe), beregnes ved hjælp af kernefunktionerne fra q2-funktionen-tabel-artstabellen. Visualisering vil blive udført ved hjælp af Q2-Featur-bordet-varmen (for at visualisere den relative overflod af arter) og phylotoast (Dabdoub et al., 2016). Differentialforekomst mellem arter beregnes ved hjælp af ANCOM-BC (Lin & Peddada, 2020).

6. Inflammatorisk analyse: Peri-implantat crevikulær væske og granuleringsvæv fra debridement vil blive opsamlet fra alle individer, der er involveret i undersøgelsen, på steder behandlet med peri-implantitis. Under opsamling af materialet vil det pågældende sted blive isoleret korrekt og tørret med steriliserede bomuldsruller. Den supragingival biofilm fjernes, og prøver af tandkødsvæske opnås ved at indsætte papirpunkter mellem tanden og periodontalt vævsgrænseflade i 30 sekunder (Casarin et al. 2010). To papirpoint vil blive brugt pr. Sted for at opnå et passende volumen af ​​spaltevæske. Mængden af ​​opsamlet væske måles med Periotron (Periotron 8000, Proflow Inc., Amityville, NY, USA), og papirpladserne placeres derefter i mikrocentrifuge-rør (Eppendorf), kodet for hver enkelt og eksperimentelle perioder med 150 µl phosfatbufferopløsning (PBS) og 0,05% Tween-20. Granuleringsvævet fjernet under implantatskrabning opbevares i rnalater og frosset ved -80C. Prøverne gemmes til senere analyse. Før analyse fortyndes prøverne i 60 ul buffer fra Millipore -kittet, hvirvlet i 30 minutter og derefter centrifugeres i 10 minutter ved 10.000 o / min. Prøver af hver tandkødsvæske vil blive analyseret for IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17, TNFa og IFN-Δ ved Luminex/Magpix-teknologi, som ikke kun vil bestemme tilstedeværelsen, men vil kvantificere i absolutte termer koncentrationen af ​​forskellige markører i samme prøve ved anvendelse af kommercielt tilgængelige KIT'er efter fremstillingsføreren. Kort fortiden fortyndes prøver i PBS -puffer + 5% mellem og hvirvlet i 30 sekunder inden analyse. Efter blid centrifugering placeres 25 µl supernatant i plader med 96 brønde sammen med de immunmærkede perler, der er specifikke for hver cytokin/protease. Efter inkubation med perlerne leveres sekundære antistoffer og substrat, og pladerne læses ved hjælp af Magpix -platformen. Koncentrationen af ​​hver analyt udtrykkes i PG/µl. Prøver med kvantificering under detektionsgrænsen for analysen registreres som "nul", og prøver over kvantificeringsgrænsen for standardkurven registreres med en værdi, der er lig med den højeste værdi af kurven.
7. Statistisk analyse: - Statistiske analyser udføres for at sammenligne kliniske parametre, mikrobiomsammensætning og cytokinekspression mellem grupper i hele opfølgningsperioden. - Forskellen i effektivitet mellem de to procedurer vurderes.

Alle analyser af denne forskning vil blive udført i forskningslaboratorierne i Periodontics -området i Piracicaba School of Dentistry.