Оценка имплантопластики при лечении перимимплантита.

1. Участники: взрослые пациенты с диагнозом перимиплантит (Caton et al. 2018, Papapanou et al. 2018). Пациенты будут набираются из популяции, изученной в вышеупомянутом исследовании случай-контроля, у которого был диагностирован перимиплантит; Критерии включения и исключения будут следовать критериям, ранее определенным в исследовании CADE-Control.
2. Распределение участников: участники будут случайным образом распределены на две группы: группа 1 (имплантопластика) и группа 2 (хирургический доступ). - Распределение будет выполняться компьютеризированной системой рандомизации (запечатанный envelope.com).
3. Клинические процедуры: группа 1 (имплантопластика). Пострадавшие имплантаты будут подвергаться имплантопластике, включающей ремоделирование поверхности имплантата для облегчения очистки и удаления нарушенных областей. Группа 2 (хирургический доступ): Затронутые имплантаты будут обрабатываться с помощью хирургического доступа, с механическим удалением воспаленной ткани и очисткой поверхности имплантата.
4. Клиническая оценка: первоначальные клинические параметры будут записаны до процедуры и через определенные интервалы (1, 3 и 6 месяцев после процедуры); Индексы пародонта и перимиплантата, включая индекс бляшек, кровотечение при зондировании, глубину зондирования и уровень клинического прикрепления, будут оценены калиброванным экспертом.

5. Сбор и анализ биопленки (микробиома): пробы биопленки пародонта и перимиплантата будут собраны для таксономического анализа. Все образцы будут получены до изучения пародонта. Перед сбором биопленки субгингвизации/подслизистого подслива биопленка Supraging/Supramucosal будет тщательно удалена с использованием стерильных кремов. Сайт будет изолирован с использованием хлопковых рулонов и аккуратно высушен с воздушным шприцем, чтобы избежать загрязнения слюной. Образцы биопленки будут получены стандартными точками фильтровальной бумаги с щечных поверхностей зубов/имплантатов. Точки фильтровальной бумаги будут вставлены в борьбу с десны/перимиплантацией и оставлены на месте на 30 секунд. Пятнистые пятна будут размещены в микроцентрифужной трубке, содержащей раствор Трис-Эдта. Все образцы будут немедленно заморожены и хранятся при -20 ° C до лабораторного анализа. Образцы биопленки будут удалены из бумажных полос путем добавления 200 мкл фосфатного солевого раствора (PBS) и вихря в течение 1 минуты. Пятничное место будет удалено, а ДНК выделяется с использованием комплекта Qiagen Miniamp (Валенсия, Калифорния) после рекомендаций производителя. Пероральная профилактика или нехирургическое лечение пародонта не будут инициированы до сбора образцов, и субъекты будут включены в программу пародонта по лечению по мере необходимости.

   Секвенирование ДНК и анализ данных: гипервидная область V3-V4 гена 16S рРНК будет амплифицирована с использованием праймеров и условий ПЦР, ранее описанных Klindworth et al. (2013). Согласно рекомендации производителя, очистка ПЦР будет выполнена с использованием магнитных шариков (бусин Ampure XP, Beckman Agencourt) при соотношении 0,8 шариков/объема ПЦР. После лигирования адаптеров будет выполнена новая очистка ПЦР с использованием магнитных шариков (бусин Ampure XP, Beckman Agencourt) при соотношении 1,12 шариков/объема ПЦР. Нормализация библиотеки будет выполняться с использованием набора для нормализации SequalPrep ™ (96) (Applied Biosystems ™), и комбинированная библиотека будет количественно определено. Эквимолярные концентрации ДНК будут объединены и секвенированы на платформе Illumina Miseq для получения парных последовательностей 300 п.н. Биоинформатический анализ будет выполняться с использованием QIIME 2 2020.6 (Bolyen et al., 2019). Файлы FASTQ Demultiplexed будут получены из объекта секвенирования, а Q2 Cutadapt (Martin, 2011) будет использоваться для удаления праймеров до процесса денирования, который будет выполняться с помощью Q2-DADA2 (Callahan et al., 2016). Конвейер Mafft-Fasttree (Q2-Phylogeny) будет использоваться для выравнивания всех вариантов последовательности ампликонов (ASV) с MAFFT (Katoh et al., 2002) и для построения филогения с FastTree2 (Price et al., 2010). Таксономия будет назначена ASVS с использованием классификатора Naive Bayes таксономии Q2-Feature-Classifier (Bokulich et al. 2018a), обученного в отношении расширенной базы данных микробиомов человека (Ehomd, v15.2) (Escapa et al., 2018). Alpha-diversity metrics (Shannon (Spellerberg, 2003)), beta-diversity metrics (weighted UniFrac (Lozupone et al. 2007), unweighted UniFrac (Lozupone et al. 2005)), and Principal Coordinates Analysis (PCoA) will be estimated using the q2-diversity core-metrics-phylogenetic pipeline after samples are rarefied to 10591 последовательности на выборку. Различия в альфа -разнообразии (различия в образцах) будут измерены с использованием парных различий (Bokulich et al. 2018b). Для бета-разнообразия (различия между образцами) различия между группами будут измерены с использованием тестов Permorova и PermDisp (Q2-Distersion). Основной микробиом (с учетом основного микробиома в качестве видов, присутствующих по меньшей мере в 50% образцов в группе) будет рассчитывать с использованием основных признаков из таблицы уровня видов, установленного Q2. Визуализация будет выполнена с использованием тепловой карты Q2-таблица (для визуализации относительной численности видов) и филотоаста (Dabdoub et al., 2016). Дифференциальное содержание между видами будет рассчитано с использованием Ancom-BC (Lin & Peddada, 2020).

6. Воспалительный анализ. Перимплантационная безревничная жидкость и грануляционная ткань из-за переоборудования будут собираться у всех людей, участвующих в исследовании, на участках, получавших перимиплантит. Во время сбора материала рассматриваемый сайт будет должным образом изолирован и высушен с помощью стерилизованных хлопковых рулонов. Подосмыслящая биопленка будет удалена, и образцы десны будет получена путем вставки бумажных точек между зубом и границей в тканях пародонта в течение 30 секунд (Casarin et al. 2010). Две бумажные точки будут использоваться на участок для получения адекватного объема ревикулярной жидкости. Объем собранной жидкости будет измерен с помощью Periotron (Periotron 8000, Proflow Inc., Amityville, NY, USA), а затем бумажные пятна будут размещены в микроцентрифужных пробирках (Eppendorf), кодируемые для каждого отдельного и экспериментального периода с 150 мкл раствора буфера-буфера фосфата (PBS) и 0,05% Tween-20. Грануляционная ткань, удаленная во время соскоба имплантата, будет храниться в Rnalater и заморожена при -80 ° C. Образцы будут храниться для последующего анализа. Перед анализом образцы будут разбавлены в 60 мкл буфера от комплекта Millipore, встряхиваемые в течение 30 минут, а затем центрифугируются в течение 10 минут при 10 000 об / мин. Образцы каждой десны будут анализироваться для IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17, TNFα и IFN-Δ с помощью технологии Luminex/Magpix, которая не только определит присутствие, но и количественно определять абсолютные термины концентрацию различных маркеров в одной и той же выборке, использующих коммерческие KITS, следуют инструкциям на производстве. Вкратце, образцы будут разбавлены в буфере PBS + 5% Tween и вихрят в течение 30 секунд перед анализом. После мягкого центрифугирования 25 мкл супернатанта будут размещены в 96-луночных планшетах вместе с иммуно-меченными шариками, специфичными для каждого цитокина/протеазы. После инкубации с шариками будут предоставлены вторичные антитела и субстрат, а пластины будут прочитаны с использованием платформы Magpix. Концентрация каждого аналита будет экспрессирована в PG/мкл. Образцы с количественным определением ниже предела обнаружения анализа будут записаны как «нулевые», а образцы выше предела количественной оценки стандартной кривой будут записаны со значением, равным наибольшему значению кривой.
7. Статистический анализ: - Статистический анализ будет проведен для сравнения клинических параметров, состава микробиомов и экспрессии цитокинов между группами в течение всего периода наблюдения. - Разница в эффективности между двумя процедурами будет оценена.

Все анализы этого исследования будут проведены в исследовательских лабораториях в области пародонтики Школы стоматологии Пирацикабы.