Evaluación de la implantoplastia en el tratamiento de periimplantitis.

1. Participantes: Se incluirán pacientes adultos diagnosticados con periimplantitis (Caton et al. 2018, Papapanou et al. 2018); Los pacientes serán reclutados de la población estudiada en el estudio de control de casos antes mencionado, a quienes fueron diagnosticados con periimprantitis; Los criterios de inclusión y exclusión seguirán a los criterios definidos previamente en el estudio de casos y controles.
2. Asignación de participantes: los participantes se asignarán aleatoriamente a dos grupos: grupo 1 (implantoplastia) y grupo 2 (acceso quirúrgico). - La asignación será realizada mediante un sistema de aleatorización computarizado (sellado envelope.com).
3. Procedimientos clínicos: Grupo 1 (implantoplastia): los implantes afectados se someterán a implantoplastia, que implica la remodelación de la superficie del implante para facilitar la limpieza y eliminar áreas comprometidas. Grupo 2 (acceso quirúrgico): los implantes afectados se tratarán a través del acceso quirúrgico, con la extracción mecánica del tejido inflamado y la limpieza de la superficie del implante.
4. Evaluación clínica: los parámetros clínicos iniciales se registrarán antes del procedimiento y a intervalos específicos (1, 3 y 6 meses después del procedimiento); Los índices periodontales y periimplantes, incluido el índice de placa, el sangrado en el sondeo, la profundidad de sondeo y el nivel de apego clínico, serán evaluados por un examinador calibrado.

5. Recolección y análisis de biopelículas (microbioma): muestras de biopelículas periodontales y periimplantes se recolectarán para análisis taxonómico. Todas las muestras se obtendrán antes del examen periodontal. Antes de la recolección de biopelículas subgingival/submucosa, la biopelícula supragingival/supramucosa se eliminará cuidadosamente utilizando curetas estériles. El sitio se aislará con rollos de algodón y se secará suavemente con una jeringa de aire para evitar la contaminación con la saliva. Las muestras de biopelículas se obtendrán mediante puntos de papel de filtro estándar de las superficies bucales de los dientes/implantes. Los puntos de papel de filtro se insertarán en el surco gingival/periimplant y se dejarán en su lugar durante 30 segundos. Las manchas de papel se colocarán en un tubo de microcentrífuga que contenga una solución Tris-EDTA. Todas las muestras se congelarán y almacenarán inmediatamente a -20 ° C hasta el análisis de laboratorio. Las muestras de biopelículas se eliminarán de las tiras de papel agregando 200 µl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y vórtice durante 1 minuto. El punto de papel se eliminará y se aislará el ADN utilizando el kit Qiagen miniamp (Valencia, CA) siguiendo las recomendaciones del fabricante. La profilaxis oral o el tratamiento periodontal no quirúrgico no se iniciarán antes de la recolección de muestras, y los sujetos se inscribirán en un programa de tratamiento periodontal según sea necesario.

   Secuenciación de ADN y análisis de datos: la región hipervariable V3-V4 del gen 16S rRNA se amplificará utilizando los cebadores y las condiciones de PCR previamente descrita por Klindworth et al. (2013). Según la recomendación del fabricante, la purificación de PCR se realizará utilizando perlas magnéticas (Bead XP Ampure, Beckman Agencourt) en una relación de 0.8 perlas/volumen de PCR. Después de la ligadura de los adaptadores, se realizará una nueva purificación de PCR utilizando perlas magnéticas (Bead XP Ampure, Beckman Agencourt) en una relación de 1.12 perlas/volumen de PCR. La normalización de la biblioteca se realizará utilizando el kit de placa de normalización SequalPrep ™ (96) (Applied Biosystems ™), y se cuantificará la biblioteca combinada. Las concentraciones de ADN equimolar se agruparán y secuenciarán en la plataforma Illumina Miseq para producir secuencias de extremo emparejado de 300 pb. El análisis bioinformático se realizará utilizando Qiime 2 2020.6 (Bolyen et al., 2019). Los archivos FASTQ demultiplexados se obtendrán de la instalación de secuenciación, y el cutAdapt de Q2 (Martin, 2011) se utilizará para eliminar los cebadores antes del proceso de renovación, que se realizará con Q2-DAD2 (Callahan et al., 2016). La tubería MaffT-Fasttree (Q2-Filogenia) alineada al árbol se utilizará para alinear todas las variantes de secuencia de amplicón (ASVS) con MAFFT (Katoh et al., 2002) y para construir una filogenia con FastTree2 (Price et al., 2010). La taxonomía se asignará a ASVS utilizando el clasificador de taxi-taxonomía de Bayes Naive, clasificador de características Q2 (Bokulich et al. 2018a) entrenado contra la base de datos de microbiomas oral humano expandido (Ehomd, V15.2) (Escapa et al., 2018). Métricas de Diversidad Alfa (Shannon (Spellerberg, 2003)), métricas beta-diversidad (Uniferrac ponderada (Lozupone et al. 2007), el UniferRAC no ponderado (Lozupone et al. 2005)) y el análisis de coordinados principales (POCA) se estimará utilizando el Centro de Diversidad Central de Diversidad. secuencias por muestra. Las diferencias en la diversidad alfa (diferencias dentro de las muestras) se medirán utilizando diferencias por pares (Bokulich et al. 2018b). Para la diversidad beta (diferencias entre muestras), las diferencias entre los grupos se medirán mediante pruebas de PermanOva y PermDISP (distensión Q2). El microbioma central (teniendo en cuenta el microbioma central como especies presentes en al menos el 50% de las muestras en un grupo) se calculará utilizando las características centrales de la tabla a nivel de especie de la tabla Q2. La visualización se realizará utilizando el mapa de calor de la tabla de características Q2 (para visualizar la abundancia relativa de especies) y la filotoast (Dabdoub et al., 2016). La abundancia diferencial entre especies se calculará utilizando ANCOM-BC (Lin y Peddada, 2020).

6. Análisis inflamatorio: el líquido crevicular periimplante y el tejido de granulación del desbridamiento se recolectarán de todas las personas involucradas en el estudio, en sitios tratados con periimplantitis. Durante la recolección del material, el sitio en cuestión se aislará y se secará adecuadamente con rollos de algodón esterilizados. Se eliminará la biopelícula supagingiva y se obtendrán muestras de fluido gingival insertando puntos de papel entre el diente y la interfaz de tejido periodontal durante 30 segundos (Casarin et al. 2010). Se utilizarán dos puntos de papel por sitio para obtener un volumen adecuado de fluido griegal. El volumen de líquido recolectado se medirá con el periotrón (Periotron 8000, Proflow Inc., Amityville, NY, EE. UU.) Y las manchas en papel se colocarán en tubos de microcentrífuga (Eppendorf), codificados para cada período individual y experimental con 150 µl de solución de amortiguación de fosfato (PBS) y 0.05% Tween-20. El tejido de granulación eliminado durante el raspado del implante se almacenará en Rnalater y se congelará a -80 ° C. Las muestras se almacenarán para un análisis posterior. Antes del análisis, las muestras se diluirán en 60 µl de tampón del kit Millipore, se agitarán durante 30 minutos y luego se centrifugarán durante 10 minutos a 10,000 rpm. Las muestras de cada fluido gingival se analizarán para IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17, TNFα e IFN-δ por la tecnología Luminex/Magpix, que no solo determinará la presencia, sino que cuantificará en términos absolutos de los términos absolutos de los diferentes marcadores en la misma muestra, utilizando kits disponibles en comercialmente, después de las instrucciones del fabricante. Brevemente, las muestras se diluirán en tampón PBS + Tween al 5%, y se agitarán durante 30 segundos, antes del análisis. Después de la suave centrifugación, se colocarán 25 µl de sobrenadante en placas de 96 pocillos junto con las perlas inmunolabeladas específicas para cada citocina/proteasa. Después de la incubación con las perlas, se proporcionarán anticuerpos secundarios y sustratos, y las placas se leerán utilizando la plataforma Magpix. La concentración de cada analito se expresará en PG/µL. Las muestras con cuantificación por debajo del límite de detección del análisis se registrarán como "cero", y las muestras por encima del límite de cuantificación de la curva estándar se registrarán con un valor igual al valor más alto de la curva.
7. Análisis estadístico: - Se realizarán análisis estadísticos para comparar los parámetros clínicos, la composición del microbioma y la expresión de citocinas entre grupos durante todo el período de seguimiento. - Se evaluará la diferencia en la eficacia entre los dos procedimientos.

Todos los análisis de esta investigación se realizarán en los laboratorios de investigación del área de periodoncia de la Escuela de Odontología de Piracicaba.