胚細胞腫瘍におけるリキッドバイオプシー

研究デザイン 本研究は、TGCT患者におけるctDNAの診断および予後価値を評価するための前向き非治療試験です。 オーストリアの治療センター、SAGレジストリからのセンター、およびドイツの選定されたセンターを受診する転移性TGCT患者100名に参加を依頼し、疾患経過中の特定の時点でctDNAおよびmiR-371a-3p分析のために採血を行います。 さらに、オーストリア国内のステージI疾患患者100名を対象に含めます。

サンプリング 手術前および術中：手術前に血漿およびマイクロRNAサンプルも採取します。 また、精巣静脈から術中に血漿を採取します。

精巣摘出術後（化学療法第1サイクル前）：化学療法開始前に、ctDNA分析のために2本のPAXgene® Blood ccfDNAチューブ（約20ml）に採血します。 PAXgeneチューブおよび腫瘍組織は、グラーツ医科大学バイオバンクに送付・保管されます。 miR-371a-3p収集のため、血清チューブに10ml採血し、遠心分離後、2ml血清を-80℃で保存します。

化学療法第2サイクル前：ctDNAレベルによる治療反応を評価するため、化学療法第2サイクル投与前にもう一度2本のPAXgene® Blood ccfDNAチューブ（約20ml）を採取します。 miR-371a-3p収集のため、10ml採血し、前述の通り処理します。

治療完了後：患者が一次治療を完了した時点で、ctDNA分析のためにさらに2本のPAXgene® Blood ccfDNAチューブ（約20ml）を採取します。 miR-371a-3p収集のため、10ml採血し、前述の通り処理します。

再発時：転移性TGCT患者の約20-30%が再発します。 これらは主に無反応症例、または化学療法完了後（通常2年以内）に再発する患者です。 再発時（画像所見または古典的腫瘍マーカーの上昇で確認）に、ctDNA分析のために2本のPAXgene® Blood ccfDNAチューブ（約20ml）を採取します。 miR-371a-3p収集のため、10ml採血します。

サンプル分析 腫瘍サンプルからの原発腫瘍組織DNAの包括的分子プロファイリングには、GeneRead DNA FFPE Kit（QIAGEN）を使用してDNAを単離します。 DNAはQubit（Thermo Fisher）で定量します。 組織を包括的にプロファイリングするため、duet multiomics solution evoCプラットフォームを使用します。このプラットフォームは、遺伝的変異に関するゲノム解析だけでなく、メチルシトシン（mC）とヒドロキシメチルシトシン（hmC）を区別するエピジェネティック解析も可能にします。 このようなゲノムとメチロームの組み合わせにより、オープンクロマチン領域および遺伝子発現内での両者の区別を通じて、5mCと5hmCの相関が明らかになる可能性があります。 同じデータセットを使用して、ゲノム全体のコピー数変化を推定できます。 SCNAおよび焦点性変異は、確立された内部アルゴリズムを用いて検出します。 腫瘍純度／倍数性は、確率的モデリングのための隠れマルコフモデル（HMM）であるichorCNAアルゴリズムを使用して評価します。このアルゴリズムは0.1Xまでのシーケンシングカバレッジで動作し、腫瘍分画3%までのSCNA検出を可能にします。 腫瘍組織のクローナリティが低すぎる場合、深い変異プロファイリングのためにオプションでエクソームシーケンシングを実施します。 組織からのバイモーダルデータを、進行時点の血漿サンプルおよび化学療法感受性腫瘍と比較し、獲得耐性および原発耐性に関与する因子を特定します。 手術中に収集された組織は、グラーツ医科大学病理学部門に送付され、DNA単離およびゲノムシーケンシングが行われます。

ctDNA分析 血液はPAXgene® Blood ccfDNAチューブに採取し、ヒト遺伝学研究所に送付してさらなる処理を行います。 血漿からのcfDNA抽出は、QIAsymphony PAXgene Blood ccfDNA Kit（QIAGEN）を使用して実施します。 SCNAを同定するため、sWGS（plasma-Seq）を採用し、再度ichorCNAアルゴリズムでデータを解析します。 あるいは、感度を高めるために12pゲインをスクリーニングするdPCRを実施します。 疾患再発患者の高腫瘍分画血漿サンプルは、Biomodalプラットフォームおよび全エクソームシーケンシングを用いて追加分析します。 遺伝的およびエピジェネティックプロファイルを、精巣摘出術から得られた診断組織と比較します。 当研究室では、前立腺癌プロジェクトの枠組みで既にBiomodalプラットフォームを成功裏に導入しています。 さらに、1%までの信頼性のあるバリアント検出を可能にするctDNA特異的エクソーム濃縮キットを評価済みです。 エクソームおよびBiomodalデータセットを解析するすべてのバイオインフォマティクスツールは、グラーツ医科大学ヒト遺伝学研究所で確立されています。