Biopsia Liquida nei Tumori delle Cellule Germinali

Design dello studio Questo è uno studio prospettico, non terapeutico, per testare il valore diagnostico e prognostico del ctDNA nei pazienti con TGCT. 100 pazienti con TGCT metastatico che si presentano ai centri di trattamento in Austria, ai centri del registro SAG e a centri selezionati in Germania saranno invitati a partecipare e verrà prelevato sangue per l'analisi del ctDNA e del miR-371a-3p durante il decorso della malattia in momenti definiti. Inoltre, saranno inclusi 100 pazienti con malattia di stadio I in Austria.

Campionamento Prima dell'intervento chirurgico e intraoperatorio: Saranno ottenuti anche campioni di plasma e micro RNA prima dell'intervento chirurgico. Il plasma sarà anche ottenuto intraoperatoriamente dalla vena testicolare.

Dopo l'orchiectomia (prima del 1° ciclo di chemioterapia): Il sangue verrà prelevato in due provette PAXgene® Blood ccfDNA (circa 20 ml) per l'analisi del ctDNA prima dell'inizio della chemioterapia. Le provette PAXgene e il tessuto tumorale saranno inviati e conservati presso la Biobanca dell'Università Medica di Graz. Per la raccolta del miR-371a-3p, 10 ml di sangue saranno raccolti in provette per siero, centrifugati e 2 ml di siero conservati a -80°C.

Prima del secondo ciclo di chemioterapia: Per valutare la risposta al trattamento con i livelli di ctDNA, due provette PAXgene® Blood ccfDNA (circa 20 ml) saranno raccolte prima della somministrazione del secondo ciclo di chemioterapia. Per la raccolta del miR-371a-3p, 10 ml di sangue saranno raccolti e processati come descritto sopra.

Dopo il completamento del trattamento: Quando il paziente avrà completato il trattamento di prima linea, altre due provette PAXgene® Blood ccfDNA (circa 20 ml) saranno prelevate per l'analisi del ctDNA. Per la raccolta del miR-371a-3p, 10 ml di sangue saranno raccolti e processati come descritto sopra.

Al momento della recidiva: Circa il 20-30% dei pazienti con TGCT metastatico avrà una recidiva. Questi possono essere principalmente non responder o pazienti che recidivano dopo il completamento della chemioterapia, che di solito si verifica entro due anni. Due provette PAXgene® Blood ccfDNA (circa 20 ml) saranno prelevate per l'analisi del ctDNA al momento della recidiva (evidente all'imaging o aumento dei marcatori tumorali classici). Per la raccolta del miR-371a-3p, 10 ml di sangue saranno raccolti.

Analisi dei campioni Il profilo molecolare completo del DNA del tessuto tumorale primario dai campioni di tumore sarà isolato utilizzando il Kit GeneRead DNA FFPE (QIAGEN). Il DNA sarà quantificato utilizzando il Qubit (Thermo Fisher). Per profilare in modo completo i tessuti, sarà utilizzata la piattaforma duet multiomics solution evoC, che non solo esamina il genoma rispetto alle alterazioni genetiche, ma consente anche l'analisi epigenetica differenziando tra metilcitosina (mC) e idrossimetilcitosina (hmC). Un tale genoma e metiloma combinati possono rivelare una correlazione in 5mC e 5hmC distinguendo tra i due all'interno di regioni di cromatina aperta e espressione genica. Lo stesso set di dati può essere utilizzato per inferire alterazioni di copia a livello genomico. SCNA e alterazioni focali saranno chiamate utilizzando algoritmi interni consolidati. La purezza/ploidia del tumore sarà valutata utilizzando l'algoritmo ichorCNA, un modello di Markov nascosto (HMM) per la modellazione probabilistica che funziona con coperture di sequenziamento fino a 0,1X e consente il rilevamento di SCNA fino a una frazione tumorale del 3%. Nel caso in cui la clonalità del tessuto tumorale sia troppo bassa, il sequenziamento degli esomi sarà opzionalmente eseguito per il profilo di mutazione profondo. I dati bimodali dei tessuti saranno confrontati con i campioni di plasma del momento della progressione, nonché con tumori chemiosensibili per identificare i fattori che contribuiscono alla resistenza acquisita e primaria. Il tessuto raccolto durante l'intervento chirurgico sarà inviato al dipartimento di patologia dell'Università Medica di Graz, dove saranno eseguite l'isolamento del DNA e il sequenziamento del genoma.

Analisi del ctDNA Il sangue sarà raccolto in PAXgene® Blood ccfDNA e inviato all'Istituto di Genetica Umana per ulteriori elaborazioni. L'estrazione del cfDNA dal plasma sarà eseguita utilizzando il Kit QIAsymphony PAXgene Blood ccfDNA (QIAGEN). Per identificare SCNA, impiegheremo sWGS (plasma-Seq) e analizzeremo nuovamente i dati con l'algoritmo ichorCNA. In alternativa, sarà eseguita dPCR per lo screening del guadagno 12p per aumentare la sensibilità. I campioni di plasma con un'alta frazione tumorale da pazienti con recidiva di malattia saranno ulteriormente analizzati utilizzando la piattaforma Biomodal e il sequenziamento dell'intero esoma. I profili genetici ed epigenetici saranno confrontati con il tessuto diagnostico ottenuto dall'orchiectomia. Abbiamo già implementato con successo la piattaforma Biomodal nel nostro laboratorio nell'ambito del progetto sul cancro alla prostata. Inoltre, abbiamo valutato un kit di arricchimento dell'esoma specifico per ctDNA, che consente il rilevamento affidabile di varianti fino all'1%. Tutti gli strumenti bioinformatici per analizzare i set di dati dell'esoma e Biomodal sono ben consolidati presso l'Istituto di Genetica Umana dell'Università Medica di Graz.