Biopsie tekutin u nádorů zárodečných buněk

Design studie Jedná se o prospektivní, neterapeutickou studii pro testování diagnostické a prognostické hodnoty ctDNA u pacientů s TGCT. 100 pacientů s metastatickým TGCT navštěvujících léčebná centra v Rakousku, centra ze SAG registru a vybraná centra z Německa bude požádáno o účast a bude jim odebrána krev pro analýzu ctDNA a miR-371a-3p v průběhu onemocnění v definovaných časových bodech. Kromě toho bude zařazeno 100 pacientů s onemocněním stadia I v Rakousku.

Odběr vzorků Před operací a intraoperativně: Plazma a vzorky mikro RNA budou získány také před operací. Plazma bude rovněž získána intraoperativně z testikulární žíly.

Po orchiektomii (před 1. cyklem chemoterapie): Krev bude odebrána do dvou zkumavek PAXgene® Blood ccfDNA (přibližně 20ml) pro analýzu ctDNA před zahájením chemoterapie. Zkumavky PAXgene a nádorová tkáň budou odeslány a uloženy v Biobance Lékařské univerzity v Grazu. Pro sběr miR-371a-3p bude odebráno 10ml krve do zkumavek na sérum, odstředěno a 2ml séra uloženo při -80°C.

Před druhým cyklem chemoterapie: Pro vyhodnocení odpovědi na léčbu pomocí hladin ctDNA budou před aplikací druhého cyklu chemoterapie odebrány dvě zkumavky PAXgene® Blood ccfDNA (přibližně 20ml). Pro sběr miR-371a-3p bude odebráno 10ml krve a zpracováno, jak je popsáno výše.

Po dokončení léčby: Když pacient dokončí léčbu první linie, budou pro analýzu ctDNA odebrány další dvě zkumavky PAXgene® Blood ccfDNA (přibližně 20ml). Pro sběr miR-371a-3p bude odebráno 10ml krve a zpracováno, jak je popsáno výše.

V době relapsu: Přibližně 20-30 % pacientů s metastatickým TGCT bude mít relaps. Mohou to být primárně nereagující pacienti nebo pacienti, kteří mají relaps po dokončení chemoterapie, což obvykle nastane do dvou let. V době relapsu (zřejmého na zobrazovacích vyšetřeních nebo vzestupu klasických nádorových markerů) budou pro analýzu ctDNA odebrány dvě zkumavky PAXgene® Blood ccfDNA (přibližně 20ml). Pro sběr miR-371a-3p bude odebráno 10ml krve.

Analýza vzorků Komplexní molekulární profilování DNA primární nádorové tkáně z nádorových vzorků bude izolováno pomocí sady GeneRead DNA FFPE Kit (QIAGEN). DNA bude kvantifikována pomocí Qubit (Thermo Fisher). Pro komplexní profilování tkání bude použit platforma duet multiomics solution evoC, která nejen zkoumá genom s ohledem na genetické změny, ale také umožňuje epigenetickou analýzu rozlišující mezi methylcytosinem (mC) a hydroxymethylcytosinem (hmC). Taková kombinovaná analýza genomu a methylomu může odhalit korelaci v 5mC a 5hmC rozlišením mezi nimi v oblastech otevřené chromatinu a genové exprese. Stejný datový soubor může být použit k odvození celogenomových kopiových změn. SCNA a fokální změny budou určeny pomocí zavedených vlastních algoritmů. Čistota/ploidie nádoru bude hodnocena pomocí algoritmu ichorCNA, skrytého Markovova modelu (HMM) pro pravděpodobnostní modelování, který funguje při sekvenačních pokrytích až 0,1X a umožňuje detekci SCNA až při nádorovém podílu 3 %. V případě, že klonalita nádorové tkáně je příliš nízká, bude volitelně provedeno sekvenování exomů pro hluboké profilování mutací. Bimodální data z tkání budou porovnána s plazmatickými vzorky z časového bodu progrese, stejně jako s chemosenzitivními nádory, aby byly identifikovány faktory přispívající k získané a primární rezistenci. Tkáň získaná během operace bude odeslána na patologické oddělení Lékařské univerzity v Grazu, kde bude provedena izolace DNA a sekvenování genomu.

Analýza ctDNA Krev bude odebrána do zkumavek PAXgene® Blood ccfDNA a odeslána na Ústav humánní genetiky pro další zpracování. Extrakce cfDNA z plazmy bude provedena pomocí sady QIAsymphony PAXgene Blood ccfDNA Kit (QIAGEN). Pro identifikaci SCNA použijeme sWGS (plasma-Seq) a data opět analyzujeme algoritmem ichorCNA. Alternativně bude proveden dPCR pro screening zisku 12p, aby se zvýšila citlivost. Plazmatické vzorky s vysokým nádorovým podílem od pacientů s recidivou onemocnění budou dodatečně analyzovány pomocí platformy Biomodal a sekvenování celého exomu. Genetické a epigenetické profily budou porovnány s diagnostickou tkání získanou z orchiektomie. Platformu Biomodal jsme již úspěšně implementovali v naší laboratoři v rámci projektu rakoviny prostaty. Navíc jsme vyhodnotili soupravu pro obohacení exomu specifickou pro ctDNA, která umožňuje spolehlivou detekci variant až do 1 %. Všechny bioinformatické nástroje pro analýzu exomových a Biomodal datových souborů jsou dobře zavedeny na Ústavu humánní genetiky Lékařské univerzity v Grazu.