Liquid Biopsie in Kiemceltumoren

Studieontwerp Dit is een prospectieve, niet-therapeutische studie om de diagnostische en prognostische waarde van ctDNA bij TGCT-patiënten te testen. 100 patiënten met gemetastaseerde TGCT die zich presenteren bij behandelcentra in Oostenrijk, centra uit het SAG-register en geselecteerde centra uit Duitsland, zullen worden gevraagd deel te nemen en bloed zal worden afgenomen voor ctDNA- en miR-371a-3p-analyse tijdens het verloop van de ziekte op gedefinieerde tijdstippen. Daarnaast zullen 100 patiënten met stadium I ziekte binnen Oostenrijk worden geïncludeerd.

Monsterneming Voorafgaand aan de operatie en intraoperatief: Plasma- en microRNA-monsters zullen ook worden verkregen voorafgaand aan de operatie. Plasma zal ook intraoperatief worden verkregen uit de testiculaire ader.

Na orchiëctomie (vóór de 1e cyclus chemotherapie): Bloed zal worden afgenomen in twee PAXgene® Blood ccfDNA-buizen (ongeveer 20 ml) voor ctDNA-analyse vóór de start van de chemotherapie. PAXgene-buizen en tumorweefsel zullen worden verzonden en opgeslagen in de Biobank van de Medische Universiteit van Graz. Voor de miR-371a-3p-verzameling zal 10 ml bloed worden afgenomen in serum buizen, gecentrifugeerd en 2 ml serum opgeslagen bij -80°C.

Vóór de tweede cyclus chemotherapie: Om de behandelingsrespons met ctDNA-niveaus te evalueren, zullen twee PAXgene® Blood ccfDNA-buizen (ongeveer 20 ml) worden verzameld vóór de toediening van de tweede chemotherapiecyclus. Voor de miR-371a-3p-verzameling zal 10 ml bloed worden afgenomen en verwerkt zoals hierboven beschreven.

Na voltooiing van de behandeling: Wanneer de patiënt de eerstelijnsbehandeling heeft voltooid, zullen nog twee PAXgene® Blood ccfDNA-buizen (ongeveer 20 ml) worden afgenomen voor ctDNA-analyse. Voor de miR-371a-3p-verzameling zal 10 ml bloed worden afgenomen en verwerkt zoals hierboven beschreven.

Op het moment van recidief: Ongeveer 20-30% van de patiënten met gemetastaseerde TGCT zal een recidief krijgen. Dit kunnen primair non-responders zijn of patiënten die een recidief krijgen na voltooiing van de chemotherapie, wat meestal binnen twee jaar optreedt. Twee PAXgene® Blood ccfDNA-buizen (ongeveer 20 ml) zullen worden afgenomen voor ctDNA-analyse op het moment van recidief (zichtbaar op beeldvorming of stijging van klassieke tumormarkers). Voor de miR-371a-3p-verzameling zal 10 ml bloed worden afgenomen.

Monsteranalyse Uitgebreide moleculaire profilering van het primaire tumorweefsel DNA uit tumormonsters zal worden geïsoleerd met behulp van de GeneRead DNA FFPE Kit (QIAGEN). DNA zal worden gekwantificeerd met behulp van de Qubit (Thermo Fisher). Om weefsels uitgebreid te profileren, zal het duet multiomics solution evoC-platform worden gebruikt, dat niet alleen het genoom onderzoekt met betrekking tot genetische veranderingen, maar ook epigenetische analyse mogelijk maakt, onderscheid makend tussen methylcytosine (mC) en hydroxymethylcytosine (hmC). Een dergelijk gecombineerd genoom en methyloom kan een correlatie in 5mC en 5hmC onthullen door onderscheid te maken tussen de twee binnen regio's van open chromatine en genexpressie. Dezelfde dataset kan worden gebruikt om genoomwijde kopieveranderingen af te leiden. SCNA en focale veranderingen zullen worden aangeroepen met behulp van gevestigde interne algoritmen. Tumorzuiverheid/ploidie zal worden beoordeeld met behulp van het ichorCNA-algoritme, een verborgen Markov-model (HMM) voor probabilistische modellering en werkt in sequencingdekkingen tot 0,1X en maakt detectie van SCNA mogelijk tot een tumorfractie van 3%. Indien de klonaliteit van het tumorweefsel te laag is, zal exoomsequencing optioneel worden uitgevoerd voor diepe mutatieprofilering. Bimodale gegevens van weefsels zullen worden vergeleken met plasmasamples van het tijdstip van progressie, evenals met chemosensitieve tumoren om factoren te identificeren die bijdragen aan verworven en primaire resistentie. Weefsel verzameld tijdens de operatie zal worden verzonden naar de afdeling pathologie van de Medische Universiteit van Graz, waar DNA-isolatie en genoomsequencing zullen worden uitgevoerd.

Analyse van ctDNA Bloed zal worden verzameld in PAXgene® Blood ccfDNA-buizen en verzonden naar het Instituut voor Humane Genetica voor verdere verwerking. cfDNA-extractie uit plasma zal worden uitgevoerd met behulp van de QIAsymphony PAXgene Blood ccfDNA Kit (QIAGEN). Om SCNA te identificeren, zullen we sWGS (plasma-Seq) gebruiken en de gegevens opnieuw analyseren met het ichorCNA-algoritme. Alternatief zal dPCR worden uitgevoerd om te screenen op de 12p-winst om de gevoeligheid te verhogen. Plasmasamples met een hoge tumorfractie van patiënten met ziekterecidief zullen aanvullend worden geanalyseerd met behulp van het Biomodal-platform en hele exoomsequencing. Genetische en epigenetische profielen zullen worden vergeleken met het diagnostische weefsel verkregen uit orchiëctomie. We hebben het Biomodal-platform al succesvol geïmplementeerd in ons lab in het kader van een prostaatkankerproject. Bovendien hebben we een ctDNA-specifiek exoomverrijkingskit geëvalueerd, die betrouwbare variantdetectie tot 1% mogelijk maakt. Alle bioinformatica-tools om exoom- en Biomodal-datasets te analyseren zijn goed gevestigd bij het Instituut voor Humane Genetica van de Medische Universiteit van Graz.