Flüssigbiopsie bei Keimzelltumoren

Studiendesign Dies ist eine prospektive, nicht-therapeutische Studie zur Untersuchung des diagnostischen und prognostischen Wertes von ctDNA bei TGCT-Patienten. 100 Patienten mit metastasiertem TGCT, die sich in Behandlungszentren in Österreich, Zentren des SAG-Registers und ausgewählten Zentren in Deutschland vorstellen, werden zur Teilnahme eingeladen, und es werden im Krankheitsverlauf zu definierten Zeitpunkten Blutproben für die ctDNA- und miR-371a-3p-Analyse entnommen. Zusätzlich werden 100 Patienten mit Stadium-I-Erkrankung in Österreich eingeschlossen.

Probenentnahme Vor der Operation und intraoperativ: Plasma- und microRNA-Proben werden ebenfalls vor der Operation gewonnen. Plasma wird auch intraoperativ aus der Hodenvene entnommen.

Nach der Orchiektomie (vor dem 1. Chemotherapiezyklus): Blut wird in zwei PAXgene® Blood ccfDNA-Röhrchen (ca. 20 ml) für die ctDNA-Analyse vor Beginn der Chemotherapie abgenommen. PAXgene-Röhrchen und Tumorgewebe werden an die Biobank der Medizinischen Universität Graz gesendet und dort gelagert. Für die miR-371a-3p-Sammlung werden 10 ml Blut in Serumröhrchen gesammelt, zentrifugiert und 2 ml Serum bei -80°C gelagert.

Vor dem zweiten Chemotherapiezyklus: Zur Bewertung des Therapieansprechens anhand der ctDNA-Spiegel werden zwei PAXgene® Blood ccfDNA-Röhrchen (ca. 20 ml) vor der Verabreichung des zweiten Chemotherapiezyklus gesammelt. Für die miR-371a-3p-Sammlung werden 10 ml Blut wie oben beschrieben entnommen und verarbeitet.

Nach Abschluss der Behandlung: Wenn der Patient die Erstlinientherapie abgeschlossen hat, werden weitere zwei PAXgene® Blood ccfDNA-Röhrchen (ca. 20 ml) für die ctDNA-Analyse entnommen. Für die miR-371a-3p-Sammlung werden 10 ml Blut wie oben beschrieben entnommen und verarbeitet.

Zum Zeitpunkt des Rezidivs: Etwa 20-30 % der Patienten mit metastasiertem TGCT erleiden ein Rezidiv. Dies können primäre Non-Responder oder Patienten sein, die nach Abschluss der Chemotherapie, die in der Regel innerhalb von zwei Jahren auftritt, ein Rezidiv erleiden. Zwei PAXgene® Blood ccfDNA-Röhrchen (ca. 20 ml) werden zum Zeitpunkt des Rezidivs (nachweisbar in der Bildgebung oder Anstieg klassischer Tumormarker) für die ctDNA-Analyse entnommen. Für die miR-371a-3p-Sammlung werden 10 ml Blut entnommen.

Probenanalyse Umfassende molekulare Profilierung der DNA aus Primärtumorgewebe wird aus Tumorgewebeproben unter Verwendung des GeneRead DNA FFPE Kits (QIAGEN) isoliert. Die DNA wird mit dem Qubit (Thermo Fisher) quantifiziert. Zur umfassenden Profilierung der Gewebe wird die duet multiomics solution evoC-Plattform verwendet, die nicht nur das Genom hinsichtlich genetischer Veränderungen untersucht, sondern auch eine epigenetische Analyse ermöglicht, die zwischen Methylcytosin (mC) und Hydroxymethylcytosin (hmC) unterscheidet. Ein solches kombiniertes Genom- und Methylom kann eine Korrelation in 5mC und 5hmC aufdecken, indem zwischen den beiden in Regionen offener Chromatinstruktur und Genexpression unterschieden wird. Derselbe Datensatz kann zur Ableitung genomweiter Kopienzahlveränderungen verwendet werden. SCNA und fokale Veränderungen werden mit etablierten hauseigenen Algorithmen bestimmt. Die Tumorreinheit/-ploidie wird mit dem ichorCNA-Algorithmus, einem Hidden-Markov-Modell (HMM) für die probabilistische Modellierung, bewertet, der bei Sequenzierungsabdeckungen bis zu 0,1X arbeitet und eine Detektion von SCNA bis zu einem Tumoranteil von 3 % ermöglicht. Falls die Klonalität des Tumorgewebes zu gering ist, wird optional Exomsequenzierung für tiefgreifende Mutationsprofilierung durchgeführt. Bimodale Daten aus Geweben werden mit Plasmaproben zum Zeitpunkt der Progression sowie mit chemosensitiven Tumoren verglichen, um Faktoren zu identifizieren, die zu erworbener und primärer Resistenz beitragen. Während der Operation gesammeltes Gewebe wird an die Pathologieabteilung der Medizinischen Universität Graz gesendet, wo DNA-Isolierung und Genomsequenzierung durchgeführt werden.

Analyse von ctDNA Blut wird in PAXgene® Blood ccfDNA-Röhrchen gesammelt und an das Institut für Humangenetik zur weiteren Verarbeitung gesendet. Die cfDNA-Extraktion aus Plasma wird mit dem QIAsymphony PAXgene Blood ccfDNA Kit (QIAGEN) durchgeführt. Zur Identifizierung von SCNA werden wir sWGS (plasma-Seq) einsetzen und die Daten erneut mit dem ichorCNA-Algorithmus analysieren. Alternativ wird dPCR durchgeführt, um den 12p-Gewinn zu screenen und die Sensitivität zu erhöhen. Plasmaproben mit hohem Tumoranteil von Patienten mit Krankheitsrezidiv werden zusätzlich mit der Biomodal-Plattform und Ganzexomsequenzierung analysiert. Genetische und epigenetische Profile werden mit dem diagnostischen Gewebe aus der Orchiektomie verglichen. Wir haben die Biomodal-Plattform in unserem Labor bereits erfolgreich im Rahmen eines Prostatakrebsprojekts implementiert. Darüber hinaus haben wir ein ctDNA-spezifisches Exom-Anreicherungskit evaluiert, das eine zuverlässige Variantendetektion bis zu 1 % ermöglicht. Alle Bioinformatik-Tools zur Analyse von Exom- und Biomodal-Datensätzen sind am Institut für Humangenetik der Medizinischen Universität Graz etabliert.