Biópsia Líquida em Tumores das Células Germinativas

Desenho do estudo Este é um ensaio prospetivo, não terapêutico, para testar o valor diagnóstico e prognóstico do ADNct em doentes com TGCT. Será solicitada a participação de 100 doentes com TGCT metastático que se apresentem nos centros de tratamento na Áustria, centros do registo SAG e centros selecionados da Alemanha, e será colhido sangue para análise de ADNct e miR-371a-3p durante o curso da doença em momentos definidos. Além disso, serão incluídos 100 doentes com doença em estadio I na Áustria.

Colheita de amostras Antes da cirurgia e intraoperatória: Também serão obtidas amostras de plasma e micro RNA antes da cirurgia. O plasma também será obtido intraoperatoriamente da veia testicular.

Após orquiectomia (antes do 1.º ciclo de quimioterapia): O sangue será colhido em dois tubos PAXgene® Blood ccfDNA (aprox. 20ml) para análise de ADNct antes do início da quimioterapia. Os tubos PAXgene e o tecido tumoral serão enviados e armazenados na Biobanco da Universidade Médica de Graz. Para a colheita de miR-371a-3p, serão recolhidos 10ml de sangue em tubos de soro, centrifugados e 2ml de soro armazenados a -80°.

Antes do segundo ciclo de quimioterapia: Para avaliar a resposta ao tratamento com os níveis de ADNct, serão recolhidos dois tubos PAXgene® Blood ccfDNA (aprox. 20ml) antes da aplicação do segundo ciclo de quimioterapia. Para a colheita de miR-371a-3p, serão recolhidos 10ml de sangue e processados como descrito acima.

Após conclusão do tratamento: Quando o doente tiver concluído o tratamento de primeira linha, serão colhidos mais dois tubos PAXgene® Blood ccfDNA (aprox. 20ml) para análise de ADNct. Para a colheita de miR-371a-3p, serão recolhidos 10ml de sangue e processados como descrito acima.

No momento da recidiva: Aproximadamente 20-30% dos doentes com TGCT metastático terão recidiva. Estes podem ser principalmente não respondedores ou doentes que recidivam após a conclusão da quimioterapia, o que geralmente ocorre dentro de dois anos. Serão colhidos dois tubos PAXgene® Blood ccfDNA (aprox. 20ml) para análise de ADNct no momento da recidiva (evidente em imagiologia ou aumento dos marcadores tumorais clássicos). Para a colheita de miR-371a-3p, serão recolhidos 10ml de sangue.

Análise de amostras Será realizado um perfil molecular abrangente do ADN do tecido tumoral primário a partir de amostras de tumores, utilizando o Kit GeneRead DNA FFPE (QIAGEN). O ADN será quantificado usando o Qubit (Thermo Fisher). Para perfilar os tecidos de forma abrangente, será utilizada a plataforma duet multiomics solution evoC, que não só interroga o genoma no que respeita a alterações genéticas, mas também permite a análise epigenética, diferenciando entre metilcitosina (mC) e hidroximetilcitosina (hmC). Tal combinação de genoma e metiloma pode revelar uma correlação em 5mC e 5hmC, distinguindo entre os dois dentro de regiões de cromatina aberta e expressão génica. O mesmo conjunto de dados pode ser utilizado para inferir alterações de cópia em todo o genoma. As SCNA e alterações focais serão identificadas usando algoritmos internos estabelecidos. A pureza/ploidia do tumor será avaliada usando o algoritmo ichorCNA, um modelo de Markov oculto (HMM) para a modelação probabilística e funciona em coberturas de sequenciação até 0,1X e permite uma deteção de SCNA até uma fração tumoral de 3%. Caso a clonalidade do tecido tumoral seja demasiado baixa, será opcionalmente realizada sequenciação de exomas para um perfil de mutação profundo. Dados biomodais dos tecidos serão comparados com amostras de plasma do momento da progressão, bem como com tumores quimiosensíveis, para identificar fatores que contribuem para resistência adquirida e primária. O tecido recolhido durante a cirurgia será enviado para o departamento de patologia da Universidade Médica de Graz, onde será realizada a isolamento de ADN e sequenciação do genoma.

Análise de ADNct O sangue será recolhido em PAXgene® Blood ccfDNA e enviado para o Instituto de Genética Humana para processamento adicional. A extração de cfDNA do plasma será realizada usando o Kit QIAsymphony PAXgene Blood ccfDNA (QIAGEN). Para identificar SCNA, empregaremos sWGS (plasma-Seq) e analisaremos novamente os dados com o algoritmo ichorCNA. Alternativamente, será realizada dPCR para rastrear o ganho de 12p para aumentar a sensibilidade. Amostras de plasma com frações tumorais elevadas de doentes com recidiva da doença serão adicionalmente analisadas usando a plataforma Biomodal e sequenciação de exoma completo. Os perfis genéticos e epigenéticos serão comparados com o tecido diagnóstico obtido da orquiectomia. Já implementámos com sucesso a plataforma Biomodal no nosso laboratório no âmbito de um projeto de cancro da próstata. Além disso, avaliamos um kit de enriquecimento de exoma específico para ADNct, que permite uma deteção fiável de variantes até 1%. Todas as ferramentas de bioinformática para analisar conjuntos de dados de exoma e Biomodal estão bem estabelecidas no Instituto de Genética Humana da Universidade Médica de Graz.