Væskebiopsi i kimcelle-tumorer

Studiedesign Dette er en prospektiv, ikke-terapeutisk undersøgelse, der skal teste den diagnostiske og prognostiske værdi af ctDNA hos TGCT-patienter. 100 patienter med metastatisk TGCT, der præsenterer sig på behandlingscentre i Østrig, centre fra SAG-registret og udvalgte centre fra Tyskland, vil blive bedt om at deltage, og blod vil blive taget til ctDNA- og miR-371a-3p-analyse i sygdomsforløbet på definerede tidspunkter. Derudover vil 100 patienter med stadium I-sygdom inden for Østrig blive inkluderet.

Prøvetagning Før operation og intraoperativt: Plasmaprøver og micro RNA-prøver vil også blive taget før operation. Plasma vil også blive taget intraoperativt fra testikelvenen.

Efter orkiektomi (før 1. cyklus af kemoterapi): Blod vil blive taget i to PAXgene® Blood ccfDNA-rør (ca. 20 ml) til ctDNA-analyse før starten af kemoterapien. PAXgene-rør og tumorvæv vil blive sendt og opbevaret på Biobanken ved Medizinische Universität Graz. Til miR-371a-3p-indsamlingen vil 10 ml blod blive samlet i serumrør, centrifugeret, og 2 ml serum opbevaret ved -80°C.

Før anden cyklus af kemoterapi: For at evaluere behandlingsrespons med ctDNA-niveauer vil to PAXgene® Blood ccfDNA-rør (ca. 20 ml) blive indsamlet før anden kemoterapicyklus gives. Til miR-371a-3p-indsamlingen vil 10 ml blod blive samlet og behandlet som beskrevet ovenfor.

Efter afslutning af behandling: Når patienten har afsluttet første linjes behandling, vil yderligere to PAXgene® Blood ccfDNA-rør (ca. 20 ml) blive taget til ctDNA-analyse. Til miR-371a-3p-indsamlingen vil 10 ml blod blive samlet og behandlet som beskrevet ovenfor.

Ved tidspunktet for recidiv: Cirka 20-30 % af patienter med metastatisk TGCT vil få recidiv. Disse kan primært være non-respondere eller patienter, der får recidiv efter afslutning af kemoterapi, hvilket normalt sker inden for to år. To PAXgene® Blood ccfDNA-rør (ca. 20 ml) vil blive taget til ctDNA-analyse ved tidspunktet for recidiv (synligt på billeddannelse eller stigning i klassiske tumormarkører). Til miR-371a-3p-indsamlingen vil 10 ml blod blive samlet.

Prøveanalyse Omfattende molekylær profilering af primært tumorvævs-DNA fra tumorprøver vil blive isoleret ved hjælp af GeneRead DNA FFPE Kit (QIAGEN). DNA vil blive kvantificeret ved hjælp af Qubit (Thermo Fisher). For omfattende at profilere væv vil duet multiomics-løsning evoC-platformen blive brugt, som ikke kun undersøger genomet med hensyn til genetiske ændringer, men også muliggør epigenetisk analyse, der skelner mellem methylcytosin (mC) og hydroxymethylcytosin (hmC). En sådan kombineret genom og methylom kan afsløre en korrelation i 5mC og 5hmC ved at skelne mellem de to inden for områder med åben kromatin og genekspression. Det samme datasæt kan bruges til at udlede genombredde kopiændringer. SCNA og fokale ændringer vil blive kaldt ved hjælp af etablerede interne algoritmer. Tumorrenhed/ploidi vil blive vurderet ved hjælp af ichorCNA-algoritmen, en skjult Markov-model (HMM) til probabilistisk modellering, der fungerer ved sekventeringsdækninger ned til 0,1X og muliggør detektion af SCNA ned til en tumorfraktion på 3 %. Hvis klonaliteten af tumorvævet er for lav, vil exomsekventering eventuelt blive udført til dyb mutationsprofilering. Bimodale data fra væv vil blive sammenlignet med plasmaprøver fra tidspunktet for progression samt med kemofølsomme tumorer for at identificere faktorer, der bidrager til erhvervet og primær resistens. Væv indsamlet under operation vil blive sendt til patologiafdelingen ved Medizinische Universität Graz, hvor DNA-isolering og genomsekventering vil blive udført.

Analyse af ctDNA Blod vil blive indsamlet i PAXgene® Blood ccfDNA og sendt til Institut for Humangenetik til videre behandling. cfDNA-ekstraktion fra plasma vil blive udført ved hjælp af QIAsymphony PAXgene Blood ccfDNA Kit (QIAGEN). For at identificere SCNA vil vi anvende sWGS (plasma-Seq) og igen analysere dataene med ichorCNA-algoritmen. Alternativt vil dPCR blive udført for at screene for 12p-gain for at øge følsomheden. Plasmaprøver med høje tumorfraktioner fra patienter med sygdomsrecidiv vil yderligere blive analyseret ved hjælp af Biomodal-platformen og hele exomsekventering. Genetiske og epigenetiske profiler vil blive sammenlignet med den diagnostiske vævsprøve fra orkiektomi. Vi har allerede med succes implementeret Biomodal-platformen i vores laboratorium i rammen af et prostatakrebsprojekt. Desuden har vi evalueret et ctDNA-specifikt exomberigelsessæt, der muliggør pålidelig variantdetektion ned til 1 %. Alle bioinformatikværktøjer til at analysere exom- og Biomodal-datasæt er veletablerede på Institut for Humangenetik ved Medizinische Universität Graz.