生殖细胞肿瘤中的液体活检

研究设计 这是一项前瞻性、非治疗性试验，旨在测试循环肿瘤DNA（ctDNA）在睾丸生殖细胞肿瘤（TGCT）患者中的诊断和预后价值。 来自奥地利治疗中心、SAG登记中心以及德国选定中心的100名转移性TGCT患者将被邀请参与研究，并在疾病过程中的特定时间点采集血液用于ctDNA和miR-371a-3p分析。 此外，还将纳入奥地利境内的100名I期疾病患者。

采样 手术前和术中：手术前也将采集血浆和微小RNA样本。 术中还将从睾丸静脉采集血浆。

睾丸切除术后（化疗第1周期前）：化疗开始前，将采集约20ml血液至两个PAXgene®血液cfDNA管中，用于ctDNA分析。 PAXgene管和肿瘤组织将被送往格拉茨医科大学生物样本库并存储。 对于miR-371a-3p采集，将采集10ml血液至血清管中，离心后取2ml血清在-80°C下存储。

化疗第2周期前：为评估ctDNA水平的治疗反应，将在第2个化疗周期应用前采集两个PAXgene®血液cfDNA管（约20ml）。 对于miR-371a-3p采集，将采集10ml血液并按上述方法处理。

治疗完成后：当患者完成一线治疗后，将再采集两个PAXgene®血液cfDNA管（约20ml）用于ctDNA分析。 对于miR-371a-3p采集，将采集10ml血液并按上述方法处理。

复发时：约20-30%的转移性TGCT患者会复发。 这些患者可能主要是无应答者或在化疗完成后复发的患者（通常发生在两年内）。 复发时（影像学显示或经典肿瘤标志物升高），将采集两个PAXgene®血液cfDNA管（约20ml）用于ctDNA分析。 对于miR-371a-3p采集，将采集10ml血液。

样本分析 将从肿瘤样本中提取原发肿瘤组织DNA进行全面的分子分析，使用GeneRead DNA FFPE Kit（QIAGEN）。 DNA将使用Qubit（Thermo Fisher）进行定量。 为全面分析组织，将使用duet多组学解决方案evoC平台，该平台不仅能检测遗传变异，还能进行表观遗传分析，区分甲基胞嘧啶（mC）和羟甲基胞嘧啶（hmC）。 这种结合基因组和甲基化组的方法可以通过区分开放染色质区域和基因表达中的5mC和5hmC，揭示它们之间的相关性。 同一数据集可用于推断全基因组拷贝数变异。 SCNA和局部变异将使用内部建立的算法进行识别。 肿瘤纯度/倍性将使用ichorCNA算法评估，这是一种用于概率建模的隐马尔可夫模型（HMM），适用于低至0.1X的测序覆盖度，并能检测低至3%肿瘤分数的SCNA。 如果肿瘤组织的克隆性过低，可选择进行外显子组测序以进行深度突变分析。 来自组织的双模态数据将与进展时间点的血浆样本以及化疗敏感肿瘤进行比较，以识别导致获得性和原发性耐药的因素。 手术期间收集的组织将被送往格拉茨医科大学病理科，进行DNA分离和基因组测序。

ctDNA分析 血液将采集在PAXgene®血液cfDNA管中，并送往人类遗传学研究所进行进一步处理。 血浆中的cfDNA提取将使用QIAsymphony PAXgene血液cfDNA Kit（QIAGEN）进行。 为识别SCNA，我们将采用浅层全基因组测序（plasma-Seq），并再次使用ichorCNA算法分析数据。 或者，将进行数字PCR以筛查12p增益以提高灵敏度。 对于疾病复发患者中肿瘤分数较高的血浆样本，将额外使用Biomodal平台和全外显子组测序进行分析。 遗传和表观遗传谱将与睾丸切除术获得的诊断组织进行比较。 我们已在实验室中成功实施了Biomodal平台，作为前列腺癌项目的一部分。 此外，我们评估了一种ctDNA特异性外显子组富集试剂盒，可实现低至1%的可靠变异检测。 所有用于分析外显子组和Biomodal数据集的生物信息学工具在格拉茨医科大学人类遗传学研究所均已成熟建立。