Жидкостная биопсия при герминогенных опухолях

Дизайн исследования Это проспективное нетерапевтическое исследование для оценки диагностической и прогностической ценности цтДНК у пациентов с ТГКЯ. 100 пациентов с метастатическим ТГКЯ, обращающихся в лечебные центры Австрии, центры реестра SAG и выбранные центры Германии, будут приглашены к участию, и у них будет взята кровь для анализа цтДНК и miR-371a-3p в течение заболевания в определенные моменты времени. Кроме того, будут включены 100 пациентов с заболеванием I стадии в Австрии.

Забор образцов До операции и интраоперационно: Образцы плазмы и микроРНК также будут получены до операции. Плазма также будет получена интраоперационно из тестикулярной вены.

После орхиэктомии (перед 1-м циклом химиотерапии): Кровь будет взята в две пробирки PAXgene® Blood ccfDNA (приблизительно 20 мл) для анализа цтДНК до начала химиотерапии. Пробирки PAXgene и опухолевая ткань будут отправлены и храниться в Биобанке Медицинского университета Граца. Для сбора miR-371a-3p 10 мл крови будут собраны в пробирки для сыворотки, центрифугированы, и 2 мл сыворотки будут храниться при -80°C.

Перед вторым циклом химиотерапии: Для оценки ответа на лечение по уровням цтДНК две пробирки PAXgene® Blood ccfDNA (приблизительно 20 мл) будут собраны перед введением второго цикла химиотерапии. Для сбора miR-371a-3p 10 мл крови будут собраны и обработаны, как описано выше.

После завершения лечения: Когда пациент завершит лечение первой линии, еще две пробирки PAXgene® Blood ccfDNA (приблизительно 20 мл) будут взяты для анализа цтДНК. Для сбора miR-371a-3p 10 мл крови будут собраны и обработаны, как описано выше.

В момент рецидива: Примерно 20-30% пациентов с метастатическим ТГКЯ испытают рецидив. Это могут быть первично не отвечающие на лечение пациенты или пациенты, у которых рецидив происходит после завершения химиотерапии, что обычно происходит в течение двух лет. Две пробирки PAXgene® Blood ccfDNA (приблизительно 20 мл) будут взяты для анализа цтДНК в момент рецидива (очевидного по данным визуализации или росту классических опухолевых маркеров). Для сбора miR-371a-3p будет собрано 10 мл крови.

Анализ образцов Комплексный молекулярный профиль ДНК первичной опухолевой ткани из образцов опухолей будет выделен с использованием набора GeneRead DNA FFPE Kit (QIAGEN). Количество ДНК будет определено с использованием Qubit (Thermo Fisher). Для комплексного профилирования тканей будет использована платформа duet multiomics solution evoC, которая не только исследует геном на предмет генетических изменений, но также позволяет проводить эпигенетический анализ, дифференцируя метилцитозин (mC) и гидроксиметилцитозин (hmC). Такая комбинация генома и метилома может выявить корреляцию между 5mC и 5hmC, различая их в областях открытого хроматина и экспрессии генов. Тот же набор данных может быть использован для определения изменений числа копий по всему геному. SCNA и фокальные изменения будут определены с использованием установленных внутренних алгоритмов. Чистота/плоидность опухоли будет оценена с использованием алгоритма ichorCNA, скрытой марковской модели (HMM) для вероятностного моделирования, работающей при покрытии секвенирования до 0.1X и позволяющей обнаруживать SCNA при доле опухоли до 3%. В случае если клональность опухолевой ткани слишком низка, опционально будет проведено секвенирование экзомов для глубокого профилирования мутаций. Бимодальные данные из тканей будут сравниваться с образцами плазмы на момент прогрессирования, а также с химиочувствительными опухолями для выявления факторов, способствующих приобретенной и первичной резистентности. Ткань, собранная во время операции, будет отправлена в отделение патологии Медицинского университета Граца, где будет проведена изоляция ДНК и секвенирование генома.

Анализ цтДНК Кровь будет собрана в пробирки PAXgene® Blood ccfDNA и отправлена в Институт генетики человека для дальнейшей обработки. Экстракция цфДНК из плазмы будет выполнена с использованием набора QIAsymphony PAXgene Blood ccfDNA Kit (QIAGEN). Для идентификации SCNA мы будем использовать sWGS (plasma-Seq) и снова анализировать данные с алгоритмом ichorCNA. Альтернативно, будет проведен dPCR для скрининга усиления 12p для повышения чувствительности. Образцы плазмы с высокой долей опухоли от пациентов с рецидивом заболевания будут дополнительно проанализированы с использованием платформы Biomodal и полного секвенирования экзома. Генетические и эпигенетические профили будут сравниваться с диагностической тканью, полученной при орхиэктомии. Мы уже успешно внедрили платформу Biomodal в нашей лаборатории в рамках проекта по раку простаты. Более того, мы оценили набор для обогащения экзома, специфичный для цтДНК, который позволяет надежно обнаруживать варианты с долей до 1%. Все биоинформатические инструменты для анализа данных экзома и Biomodal хорошо зарекомендовали себя в Институте генетики человека Медицинского университета Граца.