Biopsia Líquida en Tumores de Células Germinales

Diseño del estudio Este es un ensayo prospectivo, no terapéutico para probar el valor diagnóstico y pronóstico del ADNtc en pacientes con TGCT. Se invitará a participar a 100 pacientes con TGCT metastásico que acudan a centros de tratamiento en Austria, centros del registro SAG y centros seleccionados de Alemania, y se extraerá sangre para el análisis de ADNtc y miR-371a-3p durante el curso de la enfermedad en momentos definidos. Además, se incluirán 100 pacientes con enfermedad en estadio I dentro de Austria.

Muestreo Antes de la cirugía e intraoperatorio: También se obtendrán muestras de plasma y micro ARN antes de la cirugía. También se obtendrá plasma intraoperatoriamente de la vena testicular.

Después de la orquiectomía (antes del 1er ciclo de quimioterapia): Se extraerá sangre en dos tubos PAXgene® Blood ccfDNA (aprox. 20 ml) para el análisis de ADNtc antes del inicio de la quimioterapia. Los tubos PAXgene y el tejido tumoral se enviarán y almacenarán en la Biobanco de la Universidad Médica de Graz. Para la recolección de miR-371a-3p se recogerán 10 ml de sangre en tubos de suero, se centrifugarán y se almacenarán 2 ml de suero a -80°C.

Antes del segundo ciclo de quimioterapia: Para evaluar la respuesta al tratamiento con los niveles de ADNtc, se recogerán dos tubos PAXgene® Blood ccfDNA (aprox. 20 ml) antes de la aplicación del segundo ciclo de quimioterapia. Para la recolección de miR-371a-3p se recogerán 10 ml de sangre y se procesarán como se describió anteriormente.

Después de completar el tratamiento: Cuando el paciente haya completado el tratamiento de primera línea, se extraerán otros dos tubos PAXgene® Blood ccfDNA (aprox. 20 ml) para el análisis de ADNtc. Para la recolección de miR-371a-3p se recogerán 10 ml de sangre y se procesarán como se describió anteriormente.

En el momento de la recaída: Aproximadamente el 20-30% de los pacientes con TGCT metastásico recaerán. Estos pueden ser principalmente no respondedores o pacientes que recaen después de completar la quimioterapia, lo que generalmente ocurre dentro de los dos años. Se extraerán dos tubos PAXgene® Blood ccfDNA (aprox. 20 ml) para el análisis de ADNtc en el momento de la recaída (evidente en imágenes o aumento de marcadores tumorales clásicos). Para la recolección de miR-371a-3p se recogerán 10 ml de sangre.

Análisis de muestras Se realizará un perfil molecular integral del ADN del tejido tumoral primario a partir de muestras de tumores utilizando el kit GeneRead DNA FFPE (QIAGEN). El ADN se cuantificará utilizando el Qubit (Thermo Fisher). Para perfilar integralmente los tejidos se utilizará la plataforma duet multiomics solution evoC, que no solo interroga el genoma con respecto a alteraciones genéticas, sino que también permite el análisis epigenético diferenciando entre metilcitosina (mC) e hidroximetilcitosina (hmC). Un genoma y metiloma combinados de este tipo puede revelar una correlación en 5mC y 5hmC al distinguir entre los dos dentro de regiones de cromatina abierta y expresión génica. El mismo conjunto de datos puede usarse para inferir alteraciones de copia en todo el genoma. Las SCNA y alteraciones focales se identificarán utilizando algoritmos internos establecidos. La pureza/ploidía tumoral se evaluará utilizando el algoritmo ichorCNA, un modelo oculto de Markov (HMM) para el modelado probabilístico que funciona en coberturas de secuenciación hasta 0.1X y permite la detección de SCNA hasta una fracción tumoral del 3%. En caso de que la clonalidad del tejido tumoral sea demasiado baja, se realizará opcionalmente la secuenciación de exomas para un perfil de mutaciones profundo. Los datos bimodales de los tejidos se compararán con muestras de plasma del momento de la progresión, así como con tumores quimiosensibles, para identificar factores que contribuyan a la resistencia adquirida y primaria. El tejido recolectado durante la cirugía se enviará al departamento de patología de la Universidad Médica de Graz, donde se realizará el aislamiento de ADN y la secuenciación del genoma.

Análisis de ADNtc La sangre se recogerá en PAXgene® Blood ccfDNA y se enviará al Instituto de Genética Humana para su posterior procesamiento. La extracción de cfDNA del plasma se realizará utilizando el kit QIAsymphony PAXgene Blood ccfDNA (QIAGEN). Para identificar SCNA, emplearemos sWGS (plasma-Seq) y analizaremos nuevamente los datos con el algoritmo ichorCNA. Alternativamente, se realizará dPCR para detectar la ganancia de 12p y aumentar la sensibilidad. Las muestras de plasma con altas fracciones tumorales de pacientes con recurrencia de la enfermedad se analizarán adicionalmente utilizando la plataforma Biomodal y la secuenciación de exoma completo. Los perfiles genéticos y epigenéticos se compararán con el tejido diagnóstico obtenido de la orquiectomía. Ya hemos implementado con éxito la plataforma Biomodal en nuestro laboratorio en el marco de un proyecto de cáncer de próstata. Además, hemos evaluado un kit de enriquecimiento de exoma específico para ADNtc, que permite una detección confiable de variantes hasta el 1%. Todas las herramientas bioinformáticas para analizar conjuntos de datos de exoma y Biomodal están bien establecidas en el Instituto de Genética Humana de la Universidad Médica de Graz.