Biopsja płynna w nowotworach komórek zarodkowych

Projekt badania Jest to prospektywne badanie nielecznicze mające na celu przetestowanie wartości diagnostycznej i prognostycznej ctDNA u pacjentów z TGCT. 100 pacjentów z przerzutowym TGCT zgłaszających się do ośrodków leczniczych w Austrii, ośrodków z rejestru SAG oraz wybranych ośrodków z Niemiec zostanie poproszonych o udział, a krew zostanie pobrana do analizy ctDNA i miR-371a-3p w trakcie choroby w określonych punktach czasowych. Dodatkowo, 100 pacjentów z chorobą w stadium I w Austrii zostanie włączonych.

Pobieranie próbek Przed operacją i śródoperacyjnie: Próbki osocza i mikro RNA zostaną również pobrane przed operacją. Osocze będzie również pobierane śródoperacyjnie z żyły jądrowej.

Po orchidektomii (przed pierwszym cyklem chemioterapii): Krew zostanie pobrana do dwóch probówek PAXgene® Blood ccfDNA (około 20 ml) do analizy ctDNA przed rozpoczęciem chemioterapii. Probówki PAXgene oraz tkanka guza zostaną wysłane i przechowywane w Biobanku Uniwersytetu Medycznego w Grazu. Do pobrania miR-371a-3p, 10 ml krwi zostanie pobrane do probówek na surowicę, odwirowane i 2 ml surowicy przechowywane w temperaturze -80°C.

Przed drugim cyklem chemioterapii: Aby ocenić odpowiedź na leczenie za pomocą poziomów ctDNA, dwie probówki PAXgene® Blood ccfDNA (około 20 ml) zostaną pobrane przed podaniem drugiego cyklu chemioterapii. Do pobrania miR-371a-3p, 10 ml krwi zostanie pobrane i przetworzone jak opisano powyżej.

Po zakończeniu leczenia: Kiedy pacjent ukończy leczenie pierwszego rzutu, kolejne dwie probówki PAXgene® Blood ccfDNA (około 20 ml) zostaną pobrane do analizy ctDNA. Do pobrania miR-371a-3p, 10 ml krwi zostanie pobrane i przetworzone jak opisano powyżej.

W momencie nawrotu: Około 20-30% pacjentów z przerzutowym TGCT doświadczy nawrotu. Mogą to być przede wszystkim pacjenci nieodpowiadający na leczenie lub pacjenci, u których nastąpi nawrót po zakończeniu chemioterapii, co zwykle występuje w ciągu dwóch lat. Dwie probówki PAXgene® Blood ccfDNA (około 20 ml) zostaną pobrane do analizy ctDNA w momencie nawrotu (widocznego w obrazowaniu lub wzroście klasycznych markerów nowotworowych). Do pobrania miR-371a-3p, 10 ml krwi zostanie pobrane.

Analiza próbek Kompleksowe profilowanie molekularne DNA z pierwotnej tkanki guza zostanie wyizolowane z próbek guzów za pomocą zestawu GeneRead DNA FFPE Kit (QIAGEN). DNA zostanie skwantowane za pomocą Qubit (Thermo Fisher). Aby kompleksowo profilować tkanki, zostanie wykorzystana platforma duet multiomics solution evoC, która nie tylko bada genom pod kątem zmian genetycznych, ale także umożliwia analizę epigenetyczną, różnicując między metylocytozyną (mC) i hydroksymetylocytozyną (hmC). Tak połączony genom i metylom może ujawnić korelację w 5mC i 5hmC poprzez rozróżnienie między nimi w regionach otwartej chromatyny i ekspresji genów. Ten sam zestaw danych może być wykorzystany do wnioskowania o zmianach kopii w całym genomie. SCNA i zmiany ogniskowe zostaną określone za pomocą ustalonych wewnętrznych algorytmów. Czystość/ploidalność guza zostanie oceniona za pomocą algorytmu ichorCNA, ukrytego modelu Markowa (HMM) do probabilistycznego modelowania, który działa przy pokryciu sekwencjonowania do 0,1X i umożliwia wykrycie SCNA przy ułamku guza wynoszącym 3%. W przypadku, gdy klonalność tkanki guza jest zbyt niska, opcjonalnie zostanie przeprowadzone sekwencjonowanie egzomów do głębokiego profilowania mutacji. Dane bimodalne z tkanek zostaną porównane z próbkami osocza z momentu progresji, a także z guzami wrażliwymi na chemioterapię, aby zidentyfikować czynniki przyczyniające się do nabytej i pierwotnej oporności. Tkanka zebrana podczas operacji zostanie wysłana do wydziału patologii Uniwersytetu Medycznego w Grazu, gdzie zostanie przeprowadzona izolacja DNA i sekwencjonowanie genomu.

Analiza ctDNA Krew zostanie pobrana do probówek PAXgene® Blood ccfDNA i wysłana do Instytutu Genetyki Człowieka do dalszego przetwarzania. Ekstrakcja cfDNA z osocza zostanie przeprowadzona za pomocą zestawu QIAsymphony PAXgene Blood ccfDNA Kit (QIAGEN). Aby zidentyfikować SCNA, wykorzystamy sWGS (plasma-Seq) i ponownie przeanalizujemy dane za pomocą algorytmu ichorCNA. Alternatywnie, zostanie przeprowadzone dPCR w celu przesiewowego wykrycia amplifikacji 12p w celu zwiększenia czułości. Próbki osocza z wysokim ułamkiem guza od pacjentów z nawrotem choroby zostaną dodatkowo przeanalizowane za pomocą platformy Biomodal i całego sekwencjonowania egzomów. Profile genetyczne i epigenetyczne zostaną porównane z tkanką diagnostyczną uzyskaną z orchidektomii. Z powodzeniem wdrożyliśmy już platformę Biomodal w naszym laboratorium w ramach projektu dotyczącego raka prostaty. Ponadto, oceniliśmy zestaw do wzbogacania egzomów specyficzny dla ctDNA, który umożliwia niezawodne wykrywanie wariantów do 1%. Wszystkie narzędzia bioinformatyczne do analizy zestawów danych egzomów i Biomodal są dobrze ugruntowane w Instytucie Genetyki Człowieka Uniwersytetu Medycznego w Grazu.