Neste-biopsia siittiösolukasvaimissa

Tutkimussuunnittelu Tämä on prospektiivinen, ei-terapeuttinen koe, jossa testataan ctDNA:n diagnostista ja ennustearvoa TGCT-potilailla. 100:ta metastasoituneen TGCT:n potilasta, jotka hakeutuvat hoitokeskuksiin Itävallassa, SAG-rekisterin keskuksiin ja valituille keskuksille Saksassa, pyydetään osallistumaan, ja veri otetaan ctDNA:n ja miR-371a-3p-analyysiä varten sairauden aikana määritellyissä ajankohdissa. Lisäksi 100:ta tautiasteen I potilasta Itävallassa sisällytetään.

Näytteenotto Ennen leikkausta ja leikkauksen aikana: Plasma- ja mikro-RNA-näytteet otetaan myös ennen leikkausta. Plasmaa otetaan myös leikkauksen aikana kiveksen laskimosta.

Orkidektomian jälkeen (ennen ensimmäistä kemoterapiakierrosta): Veri otetaan kahteen PAXgene® Blood ccfDNA-putkeen (n. 20 ml) ctDNA-analyysiä varten ennen kemoterapian aloittamista. PAXgene-putket ja kasvainkudos lähetetään ja varastoidaan Grazin lääketieteellisen yliopiston biopankkiin. MiR-371a-3p-keräystä varten 10 ml verta kerätään seerumiputkiin, sentrifugoidaan ja 2 ml seerumia varastoidaan -80 °C:ssa.

Ennen toista kemoterapiakierrosta: Arvioidakseen hoidon vastetta ctDNA-pitoisuuksilla, kaksi PAXgene® Blood ccfDNA-putkea (n. 20 ml) kerätään ennen toisen kemoterapiakierroksen antamista. MiR-371a-3p-keräystä varten 10 ml verta kerätään ja käsitellään kuten edellä kuvattu.

Hoidon päätyttyä: Kun potilas on suorittanut ensimmäisen linjan hoidon, toiset kaksi PAXgene® Blood ccfDNA-putkea (n. 20 ml) otetaan ctDNA-analyysiä varten. MiR-371a-3p-keräystä varten 10 ml verta kerätään ja käsitellään kuten edellä kuvattu.

Taudin uusiutumisen yhteydessä: Noin 20–30 % metastasoituneen TGCT:n potilaista saa uusiutumisen. Nämä voivat olla ensisijaisesti ei-vastaajia tai potilaita, joilla tauti uusiutuu kemoterapian päätyttyä, mikä yleensä tapahtuu kahden vuoden kuluessa. Kaksi PAXgene® Blood ccfDNA-putkea (n. 20 ml) otetaan ctDNA-analyysiä varten tautiuusiutumisen yhteydessä (ilmenee kuvantamisessa tai klassisten kasvainmarkkerien nousussa). MiR-371a-3p-keräystä varten 10 ml verta kerätään.

Näytteenanalyysi Primäärikasvainkudoksen DNA:n kattava molekyyliprofilaatio: Kasvainnäytteiden DNA eristetään käyttäen GeneRead DNA FFPE -sarjaa (QIAGEN). DNA:n määrä mitataan Qubitilla (Thermo Fisher). Kudosten kattavaa profilaatiota varten käytetään duet multiomics -ratkaisun evoC-alustaa, joka ei ainoastaan tutki genomia geneettisten muutosten suhteen, vaan mahdollistaa myös epigeneettisen analyysin erottaen metyylisytosiinin (mC) ja hydroksimetyylisytosiinin (hmC). Tällainen yhdistetty genomi ja metylomi voi paljastaa korrelaation 5mC:n ja 5hmC:n välillä erottamalla ne avoimen kromatiinin ja geeniekspression alueilla. Samaa aineistoa voidaan käyttää genominlaajuisten kopiomuutosten päättelemiseen. SCNA:t ja fokaaliset muutokset määritetään käyttäen vakiintuneita sisäisiä algoritmeja. Kasvainpuhtaus/ploidisuus arvioidaan käyttäen ichorCNA-algoritmia, piilotettua Markov-mallia (HMM) todennäköisyysmallinnukseen, joka toimii sekvensointipeitteisyyksissä alkaen 0.1X:stä ja mahdollistaa SCNAn havaitsemisen kasvainosuudessa alkaen 3 %:sta. Jos kasvainkudoksen klonaalisuus on liian alhainen, eksomisekvensointi suoritetaan valinnaisesti syvälle mutaatioprofilointiin. Kaksimuotoista aineistoa kudoksista verrataan plasmänäytteisiin etenemisvaiheen ajalta sekä kemoterapialle herkkiin kasvaimiin tunnistaakseen hankitun ja primäärin resistenssin aiheuttavia tekijöitä. Leikkauksen aikana kerätty kudos lähetetään Grazin lääketieteellisen yliopiston patologian osastolle, jossa DNA:n eristys ja genomin sekvensointi suoritetaan.

ctDNA:n analyysi Veri kerätään PAXgene® Blood ccfDNA -putkiin ja lähetetään Ihmisen perinnöllisyystieteen instituuttiin jatkokäsittelyä varten. cfDNA:n eristys plasmasta suoritetaan käyttäen QIAsymphony PAXgene Blood ccfDNA -sarjaa (QIAGEN). SCNA:iden tunnistamiseksi käytämme sWGS:ää (plasma-Seq) ja analysoimme aineiston uudelleen ichorCNA-algoritmilla. Vaihtoehtoisesti suoritetaan dPCR seulomaan 12p-kasvua herkkyyden lisäämiseksi. Korkean kasvainosuuden omaavat plasmänäytteet tautiuusiutumisen potilailta analysoidaan lisäksi Biomodal-alustalla ja kokonaisella eksomisekvensoinnilla. Geneettisiä ja epigeneettisiä profiileja verrataan orkidektomiasta saatavaan diagnostiseen kudokseen. Olemme jo onnistuneesti toteuttaneet Biomodal-alustan laboratoriossamme eturauhassyöpäprojektin puitteissa. Lisäksi olemme arvioineet ctDNA-spesifisen eksomienrikastussarjan, joka mahdollistaa luotettavan varianttien havaitsemisen alkaen 1 %:sta. Kaikki eksomi- ja Biomodal-aineistoja analysoivat bioinformatiikan työkalut ovat hyvin vakiintuneet Grazin lääketieteellisen yliopiston Ihmisen perinnöllisyystieteen instituutissa.