Biopsie liquide dans les tumeurs germinales

Conception de l'étude Il s'agit d'un essai prospectif non thérapeutique visant à évaluer la valeur diagnostique et pronostique de l'ADNct chez les patients atteints de TGCT. 100 patients atteints de TGCT métastatique se présentant dans les centres de traitement en Autriche, les centres du registre SAG et des centres sélectionnés en Allemagne seront invités à participer et du sang sera prélevé pour l'analyse de l'ADNct et du miR-371a-3p au cours de la maladie à des moments définis. De plus, 100 patients atteints d'une maladie de stade I en Autriche seront inclus.

Échantillonnage Avant la chirurgie et peropératoire : Des échantillons de plasma et d'ARN micro seront également obtenus avant la chirurgie. Le plasma sera également obtenu peropératoirement à partir de la veine testiculaire.

Après l'orchidectomie (avant le 1er cycle de chimiothérapie) : Du sang sera prélevé dans deux tubes PAXgene® Blood ccfDNA (environ 20 ml) pour l'analyse de l'ADNct avant le début de la chimiothérapie. Les tubes PAXgene et le tissu tumoral seront envoyés et stockés à la Biobanque de l'Université médicale de Graz. Pour la collecte du miR-371a-3p, 10 ml de sang seront recueillis dans des tubes à sérum, centrifugés et 2 ml de sérum seront stockés à -80°C.

Avant le deuxième cycle de chimiothérapie : Pour évaluer la réponse au traitement avec les niveaux d'ADNct, deux tubes PAXgene® Blood ccfDNA (environ 20 ml) seront collectés avant l'administration du deuxième cycle de chimiothérapie. Pour la collecte du miR-371a-3p, 10 ml de sang seront recueillis et traités comme décrit ci-dessus.

Après la fin du traitement : Lorsque le patient aura terminé le traitement de première intention, deux autres tubes PAXgene® Blood ccfDNA (environ 20 ml) seront prélevés pour l'analyse de l'ADNct. Pour la collecte du miR-371a-3p, 10 ml de sang seront recueillis et traités comme décrit ci-dessus.

Au moment de la rechute : Environ 20 à 30 % des patients atteints de TGCT métastatique rechuteront. Il peut s'agir principalement de non-répondeurs ou de patients qui rechutent après la fin de la chimiothérapie, ce qui se produit généralement dans les deux ans. Deux tubes PAXgene® Blood ccfDNA (environ 20 ml) seront prélevés pour l'analyse de l'ADNct au moment de la rechute (évidente à l'imagerie ou à l'augmentation des marqueurs tumoraux classiques). Pour la collecte du miR-371a-3p, 10 ml de sang seront recueillis.

Analyse des échantillons Un profilage moléculaire complet de l'ADN du tissu tumoral primaire à partir d'échantillons de tumeurs sera isolé à l'aide du kit GeneRead DNA FFPE (QIAGEN). L'ADN sera quantifié à l'aide du Qubit (Thermo Fisher). Pour profiler de manière exhaustive les tissus, la plateforme de solution multiomique duet evoC sera utilisée, qui interroge non seulement le génome en ce qui concerne les altérations génétiques, mais permet également une analyse épigénétique différenciant la méthylcytosine (mC) et l'hydroxyméthylcytosine (hmC). Une telle combinaison de génome et de méthylome peut révéler une corrélation entre la 5mC et la 5hmC en les distinguant dans les régions de chromatine ouverte et d'expression génique. Le même ensemble de données peut être utilisé pour déduire les altérations de copies à l'échelle du génome. Les altérations SCNA et focales seront appelées à l'aide d'algorithmes internes établis. La pureté/ploïdie tumorale sera évaluée à l'aide de l'algorithme ichorCNA, un modèle de Markov caché (HMM) pour la modélisation probabiliste fonctionnant avec des couvertures de séquençage jusqu'à 0,1X et permettant une détection des SCNA jusqu'à une fraction tumorale de 3 %. Si la clonalité du tissu tumoral est trop faible, un séquençage d'exomes sera éventuellement réalisé pour un profilage profond des mutations. Les données bimodales des tissus seront comparées aux échantillons plasmatiques du moment de la progression ainsi qu'aux tumeurs chimiosensibles pour identifier les facteurs contribuant à la résistance acquise et primaire. Le tissu collecté pendant la chirurgie sera envoyé au service de pathologie de l'Université médicale de Graz où l'isolement de l'ADN et le séquençage du génome seront effectués.

Analyse de l'ADNct Le sang sera collecté dans des tubes PAXgene® Blood ccfDNA et envoyé à l'Institut de génétique humaine pour un traitement ultérieur. L'extraction d'ADNcf à partir du plasma sera réalisée à l'aide du kit QIAsymphony PAXgene Blood ccfDNA (QIAGEN). Pour identifier les SCNA, nous utiliserons le sWGS (plasma-Seq) et analyserons à nouveau les données avec l'algorithme ichorCNA. Alternativement, une dPCR sera réalisée pour dépister le gain du 12p afin d'augmenter la sensibilité. Les échantillons plasmatiques avec une fraction tumorale élevée de patients présentant une récidive de la maladie seront en outre analysés à l'aide de la plateforme Biomodal et du séquençage complet de l'exome. Les profils génétiques et épigénétiques seront comparés au tissu diagnostique obtenu lors de l'orchidectomie. Nous avons déjà mis en œuvre avec succès la plateforme Biomodal dans notre laboratoire dans le cadre d'un projet sur le cancer de la prostate. De plus, nous avons évalué un kit d'enrichissement d'exome spécifique à l'ADNct, qui permet une détection fiable des variants jusqu'à 1 %. Tous les outils bioinformatiques pour analyser les ensembles de données d'exome et Biomodal sont bien établis à l'Institut de génétique humaine de l'Université médicale de Graz.