脳卒中における二次障害を予測するためのウェットおよびドライバイオマーカー：研究から臨床応用へ - NIMBLE研究 (NIMBLE)

背景 再灌流成功にもかかわらず、梗塞増大（IG）、出血性転換（HT）、脳浮腫（CE）は虚血性脳卒中患者の予後不良に関連する主要因子である。 無効再灌流と再灌流障害はこれらの有害現象と関連しているが、その機序は大部分が未解明であり、結果として予測と阻害が困難である。 様々な研究により、いくつかの循環バイオマーカーがIG、HT、CEの発症と関連していることが示されている。

NIMBLE研究（Integrating novel NeuroImaging Measurements and circulating Biomarkers for the prediction of secondary injury foLlowing strokE: from bench to bedside）は、ヒトにおける臨床研究と動物における実験的研究を含むトランスレーショナルプロジェクトである。 その目的は、ヒトにおいて神経画像異常と機能的転帰に関連する循環バイオマーカーを研究することにより、虚血後のIG、HT、CEに寄与する可能性のある因子を調査することである。 マウスでは、細胞およびサブ細胞レベルでの神経再編とCEの実験的評価に関連する循環バイオマーカーが研究される。

臨床設定

研究デザイン：

単一施設、縦断的、追跡前向き観察研究であり、症状発現から12時間以内に救急科を受診した前循環急性虚血性脳卒中患者の連続症例を登録する。再灌流療法の有無は問わない。

全ての患者は神経画像評価および複数の血清循環バイオマーカーの用量測定のための採血を受ける（詳細は下記参照）。

患者登録期間は2021年4月24日から2023年6月30日までで、合計213名の患者、中央年齢[四分位範囲（IQR）] 80 [16] 歳、女性46％、ベースラインNIHSS（National Institutes of Health Stroke Scale）中央値[IQR] 10 [3]。

作業方法論：

臨床評価：

脳卒中リスク因子、急性期脳卒中治療、脳卒中前投薬を含む全範囲の臨床データが各患者について記録される。 脳卒中重症度は、ベースライン時および1日、7日、90日後の追跡時にNIHSSを用いて測定され、脳卒中後障害は、3ヶ月後に診察または電話インタビューで実施される修正Rankin Scale（mRS）により評価される。

神経放射線学的評価：

神経放射線学的評価は臨床データに対して盲検化されている。 脳画像には、ベースライン時の単純CT、および臨床的に適応があれば、ベースライン時のCT（Computed Tomography）多相血管造影およびCT灌流が含まれる。 24時間後のCT、および5日後の非造影MRI（拡散強調画像（DWI）、見かけの拡散係数（ADC）、FLAIR（fluid-attenuated inversion recovery）、高速磁場エコー（FFE）シーケンスを含む）が実施される。

早期虚血兆候（Alberta Stroke Programme Early CT [ASPECTS] スコア）、小血管病の存在と重症度、CEおよびHTの存在と重症度が、ベースライン時および追跡時のCTスキャンにおいて2人の神経放射線科医により評価される。

CEはSITS-ISTR（Safe Implementation of Treatments in Stroke - International Stroke Thrombolysis Register）基準に従って分類される：

COED1 = 半球の3分の1までの限局性脳腫脹、COED2 = 半球の3分の1を超える限局性脳腫脹、COED3 = 正中線偏位を伴う脳腫脹、NONE = 脳浮腫なし。

HTはECASS（European Cooperative Acute Stroke Study）放射線学的分類に従って評価される：

HI-1: 出血性梗塞タイプ1 = 小さな点状出血 HI-2: 出血性梗塞タイプ2 = より融合性の点状出血 PH-1: 実質内血腫タイプ1 = 梗塞領域の30％未満で軽度の占拠効果あり PH-2: 実質内血腫タイプ2 = 梗塞領域の30％超で著明な占拠効果あり。 局所的な臨床プロトコルに従って得られた灌流データは、梗塞中心部と低灌流容積を検出するために専門の神経放射線科医により評価される。

さらに、浮腫のMRIによる特徴付けが行われ、信号特性と病変形態を分析することにより、血管原性浮腫と細胞毒性浮腫を区別する。

また、脳腫脹（CEおよびHTによる）を定量化し、病変増大と最終梗塞容積を定義する新しい方法であるAnatomical Distortion（AD）も適用される。

2人の専門オペレーターが、24時間後のCTスキャンで見える虚血病変の手動マッピング（「マスク」）を独立して作成する。 一方のオペレーターによって、5日後のMRI（Magnetic Resonance Imaging）スキャン（DWIシーケンス使用）上でも病変「マスク」が定義される。 不一致は別の神経放射線科医により解決される。 このプロセスには、FSLeyesが使用される。これはFSLソフトウェア（FMRIB [Functional Magnetic Resonance Imaging of the Brain] Software Library v6.0、Analysis Group, FMRIB, Oxford, UK作成）に含まれるソフトウェアで、各患者について、全てのCT断面の梗塞組織をカバーする3次元病変マスクを生成する可能性を提供する。 既存/非急性虚血病変（ベースラインCTですでに存在するもの）はマスクに含まれない。

ADは、ベースラインCTと24時間後のCTおよび5日後のMRIスキャンを比較することにより評価される。 この測定値を得るために必要なステップには、追跡スキャンで見える虚血病変を「マスク」（前述）を用いて描出することと、登録（registration）が含まれる。登録は、異なる時間や個体間であっても脳の異なる画像を正確に比較することを可能にする手順である。 ADは、2つの可能な登録アプローチを比較し、特に、Harston（2018年）の方法に従った線形および非線形登録を通じて処理された病変マスク間の差を定量化することにより計算できる。 全ての画像処理と分析は、オックスフォード大学の研究グループによって開発された無料アクセスソフトウェアであるFSLソフトウェア（FMRIB Software Library v6.0、Analysis Group, FMRIB, Oxford, UK作成）を用いて行われる。 総病変容積からADを差し引くことにより、研究者は補正梗塞容積を得ることができる。

実験室プロトコル：

バイオマーカー測定は臨床データに対して盲検化されている。 全ての患者において、炎症、血液脳関門破壊、再灌流障害に関連する以下のバイオマーカーの血清レベルが、到着時および24時間後に測定される。

それらは、測定技術の種類と速度に応じて3つのグループに分けられる：

• 迅速に利用可能な分子：アルファ2マクログロブリン（A2M）；血清アミロイドAタンパク質（SAA）；ハプトグロビン（Hp）；高感度C反応性タンパク質（hsCRP）；ニューロン特異的エノラーゼ（NSE）；S100ベータ（S100B）
• 測定に長時間を要するバイオマーカー：プロおよび抗炎症性サイトカインとケモカイン、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMPs）とその阻害剤（TIMPs）、フォン・ヴィレブランド因子（vWF）、内皮機能不全マーカーおよびタイトジャンクションタンパク質。
• メタボロミクスおよびリポプロテオミクスバイオマーカー

全てのデータは専用の症例報告書（CRF）に報告される。

転帰指標

主要転帰指標：

1. 梗塞増大、出血性転換および脳浮腫

   副次転帰指標：

2. 機能的転帰 機能的転帰は、急性虚血性脳卒中発症3ヶ月後の修正Rankin Scaleを測定することにより評価される。

統計解析計画：

各主要放射線学的転帰と選択されたベースライン変数（循環バイオマーカーを含む）との関連を評価するために、単変量線形回帰分析が実施される。 単変量解析で転帰と関連する独立変数は多変量モデルに含められる。

別の解析では、ベースライン時の循環および放射線学的バイオマーカーと臨床変数、および3ヶ月時に記録された二値化mRSスコアとの関連を評価するために、単変量ロジスティック回帰モデルが作成される。 単変量解析で有意であることが判明したリスク因子は、後方選択基準を用いた多重ロジスティック回帰モデルに入力される。

前臨床設定

前臨床研究倫理声明：

マウスを含む全ての手順は、イタリア保健省認可番号723/2019の規制に従って実施される。

マウスは、12時間明暗サイクル下の透明プラスチックケージで飼育され、水と餌を自由摂取できる。 研究者は、Jackson Laboratories（Bar Harbor, Maine USA）のトランスジェニックマウス系統、C57BL/6J-Tg(Thy1-EGFP)MJrs/Jを使用する。

中大脳動脈（MCA）閉塞および再開通マウスモデル：

このプロジェクトでは、我々のグループが開発した一過性光血栓性遠位MCA閉塞の新しい方法が適用される。 簡潔に述べると、光血栓性MCA閉塞は、光感受性色素ローズベンガルの腹腔内注射後、遠位MCAに集束緑色レーザーを照射することにより行われる。 MCA閉塞後の選択された時間（30分、60分、90分）に、塞栓内のフィブリン結合を破壊できる紫外線（UV）LEDで閉塞した遠位MCAを照射することにより再開通が行われる。

樹状突起と脈管系のin vivo二光子イメージング：

脳卒中前の状態と比較した、脳卒中急性期後の軸索および樹状突起の構造的可塑性が調査される。 Thy1-GFPマウスでは、マウス大脳皮質への永続的光学的アクセスを可能にするために、梗塞周辺領域に頭蓋窓が作成される。 頭蓋窓の表在血管は、シナプス終末のターンオーバーと神経突起の方向性の縦断的調査を行う異なるイメージングセッションで同じ皮質領域を再追跡するためのランドマークとして使用される。 さらに、毛細血管レベルでの血管透過性が特徴付けられる。 この目的のために、イメージングセッション直前にマウスの尾静脈に蛍光色素（例：Texas Red Dextran, Thermo Fisher Scientific, USA）の全身投与が行われる。 この色素は注射後数時間有効であり、浸出が発生した場合にのみ、またその場所でのみ実質内に拡散する。 次に、標識された脈管系のイメージングスタックが、注射直後から30分後まで5分ごとに取得される。 in vivoでの血管透過性を評価するために、血管内または血管直外のいずれかを中心とした正方形の関心領域（Region of Interest）内の平均蛍光値を測定し、注射後の異なる時間点で同じ位置で測定を繰り返す。 透過性κ(t)は、Nhan（2013年）によって記述された以下の式に従って計算される： [κ(t) = (dIe/dt)/[(Ii(t)/0.55)-(Ie(t)/(Ve/Vi)]。

浮腫：

脳卒中誘導24時間後、Kenneらに従い、犠牲にされたマウスにおいて、脳浮腫の間接的測定として脳水分含有量が計算される。 脳は正中線に沿って分割され、対側と同側の組織は摘出直後に湿重量（WW）を得るために秤量される。 組織は60°Cで72時間乾燥され、乾重量（DW）を得るために秤量される。 水分含有量は湿重量のパーセンテージとして計算される；%水分含有量 = [(WW-DW)/(WW)]*100。

循環バイオマーカー調査：

患者で評価されたのと同じ血液バイオマーカーを、異なる時間点（脳卒中前、ベースライン、閉塞24時間後）でテストするために、麻酔下のマウスの眼窩後静脈洞から採血される。

統計解析：

サンプルは3つの実験群（Sham、No-Recanalized、Recanalized）に分けられる。 サンプルサイズ決定のために、研究者はANOVA検定（固定効果、omnibus、一元配置）と以下のデータを使用する：3実験群、効果量f = 0.5、α = 0.05、検出力 = 0.8（使用ソフトウェア G*Power, version 3.1.9.2, Franz Faul, University of Kiel, Germany）。 3群のマウスのデータは、異なる時間点（脳卒中前、ベースライン、脳卒中後24時間）で比較される。 シナプスターンオーバーと皮質血管の血液脳関門透過性を異なる時間点で評価するために、二光子イメージングデータに対して反復測定一元配置分散分析（ANOVA）が実施される。 データは平均±標準誤差として与えられる。

資金提供：

• トスカーナ州「Bando Salute 2018」；
• #NEXTGENERATIONEU（NGEU）および大学研究省（MUR）、国家復興レジリエンス計画（NRRP）、プロジェクトMNESYS（PE0000006） - 健康と疾患における神経系の研究のためのマルチスケール統合アプローチ（DN. 1553 11.10.2022）により資金提供。