뇌졸중 2차 손상 예측을 위한 습성 및 건성 바이오마커: 연구실에서 병상까지 - NIMBLE 연구 (NIMBLE)

배경 재관류의 성공에도 불구하고, 경색 성장(IG), 출혈성 변환(HT) 및 뇌부종(CE)은 허혈성 뇌졸중 환자의 부정적인 결과와 관련된 주요 요인입니다. 무의미한 재관류 및 재관류 손상은 이러한 유해한 현상과 관련되어 있지만, 그 메커니즘은 대부분 이해되지 않아 예측과 방지가 어렵습니다. 다양한 연구에서 일부 순환 생체표지자가 IG, HT 및 CE의 발생과 관련이 있음이 나타났습니다.

NIMBLE 연구(Integrating novel NeuroImaging Measurements and circulating Biomarkers for the prediction of secondary injury foLlowing strokE: from bench to bedside)는 인간의 임상 연구와 동물의 실험 연구를 포함하는 전환 연구 프로젝트입니다. 이 연구는 인간에서 순환 생체표지자를 신경영상 이상 및 기능적 결과와 관련하여 연구함으로써 허혈 후 IG, HT 및 CE에 기여할 수 있는 가능한 요인을 조사하는 것을 목표로 합니다. 생쥐에서는 순환 생체표지자가 세포 및 세포내 수준에서의 신경 재구성 및 CE의 실험적 평가와 관련하여 연구됩니다.

임상 환경

연구 설계:

단일 기관, 종단적, 추적 관찰 전향적 관찰 연구로, 증상 발현 후 12시간 이내에 응급실에 내원한 전방 급성 허혈성 뇌졸중 환자를 연속적으로 등록하며, 재혈관화 치료를 받았거나 받지 않은 환자를 포함합니다.

모든 환자는 신경영상 평가 및 여러 혈청 순환 생체표지자(자세한 내용은 아래 참조)의 농도 측정을 위한 혈액 채취를 받습니다.

환자 등록은 2021년 4월 24일부터 2023년 6월 30일까지 총 213명의 환자로, 중앙 연령 [사분위 범위(IQR)] 80 [16]세, 여성 46%, 중앙 기초 NIHSS(National Institutes of Health Stroke Scale) [IQR] 10 [3]이었습니다.

작업 방법론:

임상 평가:

뇌졸중 위험 요인, 급성 뇌졸중 치료, 뇌졸중 전 약물 치료를 포함한 포괄적인 임상 데이터가 각 환자에 대해 기록됩니다. 뇌졸중 중증도는 기초 및 1일, 7일, 90일 추적 관찰 시 NIHSS를 사용하여 측정되며, 뇌졸중 후 장애는 방문 또는 전화 인터뷰를 통해 3개월에 시행된 수정 Rankin 척도(mRS)로 평가됩니다.

신경방사선학적 평가:

신경방사선학적 평가는 임상 데이터에 대해 맹검 처리됩니다. 뇌 영상에는 기초 일반 CT 및 임상적으로 지시된 경우 기초 CT(컴퓨터 단층촬영) 다단계 혈관조영술 및 CT 관류가 포함됩니다. 24시간 CT 및 5일 비조영 MRI(확산강조영상(DWI), 겉보기 확산 계수(ADC), 유체 감쇠 반전 회복(FLAIR) 및 고속장 에코(FFE) 시퀀스 포함)가 수행됩니다.

조기 허혈 징후(Alberta Stroke Programme Early CT [ASPECTS] 점수), 소혈관 질환의 존재 및 중증도, CE 및 HT의 존재 및 등급은 기초 및 추적 관찰 CT 스캔에서 두 명의 신경방사선 전문의에 의해 평가됩니다.

CE는 SITS-ISTR(Safe Implementation of Treatments in Stroke - International Stroke Thrombolysis Register) 기준에 따라 분류됩니다:

COED1 = 반구의 1/3까지의 국소 뇌 부종, COED2 = 반구의 1/3 이상의 국소 뇌 부종, COED3 = 중앙선 이동을 동반한 뇌 부종, NONE = 뇌부종 없음.

HT는 ECASS(European Cooperative Acute Stroke Study) 방사선학적 분류에 따라 평가됩니다:

HI-1: 출혈성 경색 유형 1 = 작은 점상출혈 HI-2: 출혈성 경색 유형 2 = 더 융합된 점상출혈 PH-1: 실질 혈종 유형 1 = 경색 영역의 <30% 및 경도의 공간 점유 효과 PH-2: 실질 혈종 유형 2 = 경색 영역의 >30% 및 중대한 공간 점유 효과 관류 데이터는 지역 임상 프로토콜에 따라 도출되며, 전문 신경방사선 전문의에 의해 경색 핵 및 저관류 용적을 탐지하기 위해 평가됩니다.

또한, 부종의 MRI 특성 분석을 통해 혈관원성 부종과 세포독성 부종을 구별하기 위해 신호 특성 및 병변 형태를 분석합니다.

뇌 부종(CE 및 HT에 의해 유발됨)을 정량화하고 병변 성장 및 최종 경색 용적을 정의하기 위한 새로운 방법인 해부학적 변형(AD)도 적용됩니다.

두 명의 전문 작업자가 24시간 CT 스캔에서 보이는 허혈성 병변의 수동 매핑("마스크")을 독립적으로 생성합니다. 한 작업자에 의해 5일 MRI(자기 공명 영상) 스캔(DWI 시퀀스 사용)에서도 병변 "마스크"가 정의됩니다. 모든 불일치는 별도의 신경방사선 전문의에 의해 해결됩니다. 이 과정에는 FSLeyes가 사용되며, 이는 FSL 소프트웨어(FMRIB[Functional Magnetic Resonance Imaging of the Brain] Software Library v6.0, Created by the Analysis Group, FMRIB, Oxford, UK)에 포함된 소프트웨어로, 각 환자에 대해 모든 CT 단면에서 경색 조직을 포함하는 3차원 병변 마스크를 생성할 수 있는 가능성을 제공합니다. 이전/비급성 허혈성 병변(기초 CT에 이미 존재하는)은 마스크에 포함되지 않습니다.

AD는 기초 CT를 24시간 CT 및 5일 MRI 스캔과 비교하여 평가됩니다. 이 측정을 얻기 위해 필요한 단계에는 추적 관찰 스캔에서 보이는 허혈성 병변을 "마스크"(이전에 설명됨)를 사용하여 묘사하고 등록하는 것이 포함되며, 등록은 서로 다른 시간 및 개인의 뇌 영상을 정확하게 비교할 수 있게 하는 절차입니다. AD는 두 가지 가능한 등록 접근법을 비교하고 특히 Harston이 2018년에 설명한 방법에 따라 선형 및 비선형 등록을 통해 처리된 병변 마스크 간의 차이를 정량화함으로써 계산할 수 있습니다. 모든 영상 처리 및 분석은 옥스퍼드 대학교 연구 그룹이 개발한 무료 접근 소프트웨어인 FSL 소프트웨어(FMRIB Software Library v6.0, Created by the Analysis Group, FMRIB, Oxford, UK)를 사용하여 수행됩니다. 총 병변 용적에서 AD를 빼면 연구자들은 수정된 경색 용적을 얻을 수 있습니다.

실험실 프로토콜:

생체표지자 측정은 임상 데이터에 대해 맹검 처리됩니다. 모든 환자에서 염증, 혈액-뇌 장벽 손상 및 재관류 손상과 관련된 다음 혈청 생체표지자 수준이 내원 시 및 24시간 후에 측정됩니다.

이들은 측정 기술의 유형 및 속도에 따라 세 그룹으로 나눌 수 있습니다:

• 빠르게 이용 가능한 분자: 알파 2 마크로글로불린(A2M); 혈청 아밀로이드 A 단백질(SAA); 합토글로빈(Hp); 고감도 C 반응성 단백질(hsCRP); 뉴런 특이적 에놀라제(NSE); S100베타(S100B)
• 측정에 더 오랜 시간이 필요한 생체표지자: 전염증성 및 항염증성 사이토카인 및 케모카인, 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP) 및 그 억제제(TIMP), 폰 빌레브란드 인자(vWF), 내피 기능 장애 표지자 및 틈새 접합 단백질.
• 대사체학 및 지질단백질체학 생체표지자

모든 데이터는 전용 사례 보고서 양식(CRF)에 보고됩니다.

결과 측정

주요 결과 측정:

1. 경색 성장, 출혈성 변환 및 뇌부종

   부차적 결과 측정:

2. 기능적 결과 기능적 결과는 급성 허혈성 뇌졸중 발병 3개월 후 수정 Rankin 척도를 측정하여 평가됩니다.

통계 분석 계획:

각 주요 방사선학적 결과와 선택된 기초 변수(순환 생체표지자 포함) 간의 연관성을 평가하기 위해 단변량 선형 회귀 분석이 수행됩니다. 단변량 분석에서 결과와 연관된 독립 변수는 다변량 모델에 포함됩니다.

다른 분석에서는 기초 순환 및 방사선학적 생체표지자와 임상 변수 및 3개월에 기록된 이분화된 mRS 점수 간의 연관성을 평가하기 위해 단변량 로지스틱 회귀 모델이 생성됩니다. 단변량 분석에서 유의미한 것으로 발견된 위험 요인은 후진 선택 기준을 가진 다중 로지스틱 회귀 모델에 포함됩니다.

임상 전 환경

임상 전 연구 윤리 성명:

생쥐와 관련된 모든 절차는 이탈리아 보건부 승인 번호 723/2019의 규정에 따라 수행됩니다.

생쥐는 투명한 플라스틱 케이지에서 12시간 명암 주기 하에 사육되며, 물과 먹이를 자유롭게 이용할 수 있습니다. 연구자들은 Jackson Laboratories(Bar Harbor, Maine USA)의 형질전환 생쥐 계통인 C57BL/6J-Tg(Thy1-EGFP)MJrs/J를 사용합니다.

중대뇌동맥(MCA) 폐쇄 및 재개통 생쥐 모델:

이 프로젝트에서는 우리 그룹이 개발한 일시적 광혈전성 원위 MCA 폐쇄의 새로운 방법이 적용됩니다. 간략히 말해, 광혈전성 MCA 폐쇄는 광감염료 Rose Bengal의 복강 내 주사 후 초점을 맞춘 녹색 레이저로 원위 MCA를 조사하여 수행됩니다. MCA 폐쇄 후 선택된 시간(30분, 60분, 90분)에, 혈전 내 피브린 결합을 파괴할 수 있는 자외선(UV) LED로 폐쇄된 원위 MCA를 조사하여 재개통이 수행됩니다.

생체 내 이중광자 영상으로 수지상돌기 및 혈관계 촬영:

뇌졸중 전 상태와 비교하여 뇌졸중 후 급성기에서 축삭 및 수지상돌기의 구조적 가소성이 조사됩니다. Thy1-GFP 생쥐에서 경색 주변 영역에 두개골 창을 만들어 생쥐 대뇌 피질에 영구적인 광학 접근을 가능하게 합니다. 두개골 창의 표면 혈관은 시냅스 말단 회전 및 신경 과정 방향의 종단적 조사를 수행하는 서로 다른 영상 세션에서 동일한 대뇌 피질 영역을 재추적하기 위한 지표로 사용됩니다. 또한, 모세혈관 수준에서의 혈관 투과성이 특성화됩니다. 이 목적을 위해, 영상 세션 직전 생쥐의 꼬리 정맥에 형광 염료(예: Texas Red Dextran, Thermo Fisher Scientific, USA)의 전신 주사가 수행됩니다. 이 염료는 주사 후 몇 시간 동안 활성 상태를 유지하며, 혈관 외 유출이 발생하는 경우와 위치에서만 실질 조직으로 확산됩니다. 그런 다음, 주사 직후부터 30분까지 5분마다 표지된 혈관계의 영상 스택을 획득합니다. 생체 내 혈관의 투과성을 평가하기 위해, 혈관 내부 또는 바로 외부에 중심을 둔 정사각형 관심 영역 내 평균 형광 값을 측정하고 주사 후 다른 시간점에서 동일한 위치에서 측정을 반복합니다. 투과성 κ(t)는 Nhan이 2013년에 설명한 다음 공식에 따라 계산됩니다: [κ(t) = (dIe/dt)/[(Ii(t)/0.55)-(Ie(t)/(Ve/Vi)].

부종:

뇌졸중 유도 24시간 후, 희생된 생쥐에서 뇌부종의 간접적 측정으로서 뇌 수분 함량이 Kenne 및 동료들의 방법에 따라 계산됩니다. 뇌는 중앙선을 따라 분할되고 반대측 및 동측 조직은 제거 직후 습중량(WW)을 얻기 위해 계량됩니다. 조직은 60°C에서 72시간 동안 건조시켜 건중량(DW)을 얻기 위해 계량됩니다. 수분 함량은 습중량의 백분율로 계산됩니다; % 수분 함량 = [(WW-DW)/(WW)]*100.

순환 생체표지자 조사:

환자에서 평가된 동일한 혈액 생체표지자를 서로 다른 시간점(뇌졸중 전, 기초, 및 폐쇄 후 24시간)에서 검사하기 위해, 마취된 생쥐의 후안와동을 통해 혈액이 채취됩니다.

통계 분석:

표본은 세 실험 그룹(Sham, No-Recanalized, Recanalized)으로 나뉩니다. 표본 크기 결정을 위해 연구자들은 ANOVA 검정(고정 효과, 종합, 일원) 및 다음 데이터를 사용합니다: 3 실험 그룹, 효과 크기 f = 0.5, α = 0.05, 검정력 = 0.8(사용 소프트웨어 G * Power, 버전 3.1.9.2, Franz Faul, University of Kiel, Germany). 세 그룹의 생쥐 데이터는 서로 다른 시간점(뇌졸중 전, 기초, 및 뇌졸중 후 24시간)에서 비교됩니다. 시냅스 회전 및 대뇌 혈관의 혈액-뇌 장벽 투과성을 서로 다른 시간점에서 평가하기 위해 이중광자 영상 데이터에 대해 반복 측정 일원 분산 분석(ANOVA)이 수행됩니다. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차로 제공됩니다.

자금 지원:

• Tuscany Region "Bando Salute 2018";
• #NEXTGENERATIONEU(NGEU) 및 대학연구부(MUR), 국가회복탄력성계획(NRRP)의 프로젝트 MNESYS(PE0000006) - 건강과 질병에서 신경계 연구를 위한 다중 규모 통합 접근법(DN. 1553 11.10.2022)에 의해 자금 지원됨.