Nasse und trockene Biomarker zur Vorhersage sekundärer Schädigungen nach Schlaganfall: Von der Grundlagenforschung zur klinischen Anwendung - Die NIMBLE-Studie (NIMBLE)

HINTERGRUND Infarktwachstum (IG), hämorrhagische Transformation (HT) und zerebrales Ödem (CE) sind Schlüsselfaktoren, die mit einem negativen Ergebnis bei ischämischen Schlaganfallpatienten assoziiert sind, trotz des Erfolgs der Rekanalisation. Futile Reperfusion und Reperfusionsschäden sind mit diesen schädlichen Phänomenen verbunden, aber ihre Mechanismen bleiben weitgehend unverstanden und folglich sind sie schwer vorherzusagen und zu verhindern. Verschiedene Studien haben gezeigt, dass einige zirkulierende Biomarker mit der Entwicklung von IG, HT und CE assoziiert sind.

Die NIMBLE-Studie (Integration neuartiger Neuroimaging-Messungen und zirkulierender Biomarker zur Vorhersage sekundärer Schäden nach Schlaganfall: von der Grundlagenforschung zur klinischen Anwendung) ist ein translationales Projekt, das klinische Forschung am Menschen und experimentelle Studien an Tieren umfasst. Sie hat das Ziel, mögliche Faktoren, die zu IG, HT und CE nach Ischämie beitragen, durch die Untersuchung zirkulierender Biomarker in Bezug auf Neuroimaging-Abnormalitäten und funktionelle Ergebnisse beim Menschen zu erforschen. Bei Mäusen werden zirkulierende Biomarker in Bezug auf die neuronale Reorganisation auf zellulärer und subzellulärer Ebene und die experimentelle Bewertung von CE untersucht.

KLINISCHE UMGEBUNG

Studiendesign:

Einzelzentrums-, longitudinale, prospektive Beobachtungsstudie mit Nachuntersuchung, die eine konsekutive Reihe von Patienten mit akutem ischämischem Schlaganfall im vorderen Stromgebiet einschließt, die innerhalb von 12 Stunden nach Symptombeginn in der Notaufnahme vorstellig werden, entweder behandelt oder nicht behandelt mit Revaskularisationstherapien.

Alle Patienten unterziehen sich einer Neuroimaging-Bewertung und Blutentnahme für die Dosierung mehrerer Serum-basierter zirkulierender Biomarker (siehe unten für Details).

Die Patientenrekrutierung erfolgte zwischen dem 24.04.2021 und dem 30.06.2023 für insgesamt 213 Patienten, medianes Alter [IQR (Interquartilsbereich)] 80 [16] Jahre, 46 % weiblich, medianer Baseline-NIHSS (National Institutes of Health Stroke Scale) [IQR] 10 [3]

Arbeitsmethodik:

Klinische Bewertung:

Ein vollständiger Satz klinischer Daten, einschließlich Schlaganfallrisikofaktoren, akuter Schlaganfallbehandlung, Medikation vor dem Schlaganfall, wird für jeden Patienten erfasst. Die Schlaganfallschwere wird mittels NIHSS bei Baseline und bei 1, 7 und 90 Tagen Nachuntersuchung gemessen, und die Behinderung nach Schlaganfall durch die modifizierte Rankin-Skala (mRS), die nach 3 Monaten durch Besuch oder Telefoninterview erhoben wird.

Neuroradiologische Bewertung:

Die neuroradiologische Bewertung erfolgt verblindet zu klinischen Daten. Die Bildgebung des Gehirns umfasst Baseline-Nativ-CT und, falls klinisch indiziert, CT (Computertomographie) Mehrphasenangiographie und CT-Perfusion bei Baseline. CT nach 24 h und MRT ohne Kontrastmittel nach 5 Tagen (einschließlich diffusionsgewichteter Bildgebung (DWI), apparent diffusion coefficient (ADC), Fluid-Attenuated Inversion Recovery (FLAIR) und Fast Field Echo (FFE) Sequenzen) werden durchgeführt.

Frühe ischämische Zeichen (Alberta Stroke Programme Early CT [ASPECTS] Score), Vorhandensein und Schweregrad einer Kleingefäßerkrankung, Vorhandensein und Graduierung von CE und HT werden durch zwei Neuroradiologen bei Baseline- und Nachuntersuchungs-CT-Scans beurteilt.

CE wird gemäß den SITS-ISTR-Kriterien (Safe Implementation of Treatments in Stroke - International Stroke Thrombolysis Register) klassifiziert:

COED1 = fokale Hirnschwellung bis zu einem Drittel der Hemisphäre, COED2 = fokale Hirnschwellung größer als ein Drittel der Hemisphäre, COED3 = Hirnschwellung mit Mittellinienverlagerung, NONE = Fehlen von zerebralem Ödem.

HT wird gemäß der ECASS (European Cooperative Acute Stroke Study) radiographischen Klassifikation beurteilt:

HI-1: Hämorrhagischer Infarkt Typ 1 = kleine Petechien HI-2: Hämorrhagischer Infarkt Typ 2 = mehr konfluente Petechien PH-1: Parenchymales Hämatom Typ 1 = <30% des infarktierten Areals mit mildem raumforderndem Effekt PH-2: Parenchymales Hämatom Typ 2 = >30% des infarktierten Areals mit signifikantem raumforderndem Effekt Perfusionsdaten, die gemäß lokalem klinischem Protokoll abgeleitet werden, werden von einem erfahrenen Neuroradiologen ausgewertet, um Infarktkern- und Hypoperfusionsvolumina zu detektieren.

Darüber hinaus wird eine MRT-Charakterisierung des Ödems durchgeführt, um vasogenes Ödem von zytotoxischem Ödem zu unterscheiden, indem die Signalcharakteristika und die Läsionsmorphologie analysiert werden.

Eine neue Methode zur Quantifizierung der Hirnschwellung (induziert durch CE und HT) und zur Definition von Läsionswachstum und endgültigem Infarktvolumen, genannt Anatomical Distortion (AD), wird ebenfalls angewendet.

Zwei erfahrene Operatoren werden unabhängig voneinander eine manuelle Kartierung ("Maske") der auf dem 24-Stunden-CT-Scan sichtbaren ischämischen Läsion erstellen. Eine Läsions-„Maske“ wird von einem Operator auch auf dem 5-Tage-MRT (Magnetresonanztomographie)-Scan (unter Verwendung der DWI-Sequenz) definiert. Diskrepanzen werden durch einen separaten Neuroradiologen gelöst. Für diesen Prozess wird FSLeyes verwendet, eine im FSL-Softwarepaket (FMRIB [Functional Magnetic Resonance Imaging of the Brain] Software Library v6.0, erstellt von der Analysis Group, FMRIB, Oxford, UK) enthaltene Software, die die Möglichkeit bietet, für jeden Patienten eine dreidimensionale Läsionsmaske zu generieren, die das Infarktgewebe auf allen CT-Schichten abdeckt. Vorherige/nicht-akute ischämische Läsionen (bereits im Baseline-CT vorhanden) werden nicht in die Masken einbezogen.

AD wird durch Vergleich des Baseline-CT mit den 24-Stunden-CT- und 5-Tage-MRT-Scans bewertet. Die zur Erlangung dieser Messung erforderlichen Schritte umfassen die Abgrenzung der auf Nachuntersuchungs-Scans sichtbaren ischämischen Läsion unter Verwendung einer „Maske“ (wie zuvor beschrieben) und Registrierung, ein Verfahren, das genauen Vergleich zwischen verschiedenen Bildern des Gehirns ermöglicht, auch zu unterschiedlichen Zeitpunkten und bei verschiedenen Individuen. AD kann durch Vergleich der zwei möglichen Registrierungsansätze berechnet werden, insbesondere durch Quantifizierung der Differenz zwischen den Läsionsmasken, die durch Lineare und Nicht-Lineare Registrierung verarbeitet wurden, gemäß der von Harston 2018 beschriebenen Methode. Alle Bildverarbeitungs- und Analyseschritte werden unter Verwendung der FSL-Software (FMRIB Software Library v6.0, erstellt von der Analysis Group, FMRIB, Oxford, UK) durchgeführt, einer frei zugänglichen Software, die von einer Forschungsgruppe der Universität Oxford entwickelt wurde. Durch Subtraktion von AD vom Gesamtläsionsvolumen können die Untersucher das korrigierte Infarktvolumen erhalten.

Laborprotokoll:

Die Biomarker-Messungen erfolgen verblindet zu klinischen Daten. Bei allen Patienten werden die folgenden Serumspiegel von Biomarkern, die mit Entzündung, Blut-Hirn-Schranken-Störung und Reperfusionsschäden verbunden sind, bei Aufnahme und nach 24 Stunden gemessen.

Sie können je nach Art und Geschwindigkeit der Messtechnik in drei Gruppen eingeteilt werden:

• schnell verfügbare Moleküle: Alpha-2-Makroglobulin (A2M); Serum-Amyloid-A-Protein (SAA); Haptoglobin (Hp); hochsensitives C-reaktives Protein (hsCRP); Neuron-spezifische Enolase (NSE); S100Beta (S100B)
• Biomarker, die längere Zeit zur Messung benötigen: pro- und anti-entzündliche Zytokine und Chemokine, Matrix-Metalloproteasen (MMPs) und ihre Inhibitoren (TIMPs), von-Willebrand-Faktor (vWF), Endotheldysfunktionsmarker und Tight-Junction-Proteine.
• Metabolomische und Lipoproteomische Biomarker

Alle Daten werden in einem speziellen Fallberichtsformular (CRF) erfasst.

Ergebnismessung

Primärer Endpunkt:

1. Infarktwachstum, Hämorrhagische Transformation und Zerebrales Ödem

   Sekundärer Endpunkt:

2. Funktionelles Ergebnis Das funktionelle Ergebnis wird durch Messung der modifizierten Rankin-Skala 3 Monate nach Beginn des akuten ischämischen Schlaganfalls bewertet.

Statistischer Analyseplan:

Univariate lineare Regressionsanalysen werden durchgeführt, um die Assoziation zwischen jedem primären radiologischen Ergebnis und ausgewählten Baseline-Variablen (einschließlich zirkulierender Biomarker) zu bewerten. Unabhängige Variablen, die mit dem Ergebnis in der univariaten Analyse assoziiert sind, werden in multivariate Modelle aufgenommen.

In einer weiteren Analyse werden univariate logistische Regressionsmodelle erstellt, um die Assoziation zwischen Baseline-zirkulierenden und radiologischen Biomarkern und klinischen Variablen und dem dichotomisierten mRS-Score, der nach drei Monaten erfasst wurde, zu bewerten. Die Risikofaktoren, die in einer univariaten Analyse signifikant sind, gehen in ein multiples logistisches Regressionsmodell mit einem Backward-Selection-Kriterium ein.

PRÄKLINISCHE UMGEBUNG

Ethische Erklärung präklinische Forschung:

Alle Verfahren mit Mäusen werden gemäß den Vorschriften des italienischen Gesundheitsministeriums, Genehmigung Nr. 723/2019, durchgeführt.

Mäuse werden in durchsichtigen Plastikkäfigen unter einem 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus gehalten und haben freien Zugang zu Wasser und Futter. Die Untersucher verwenden eine transgene Mäuselinie, C57BL/6J-Tg(Thy1-EGFP)MJrs/J, von Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine, USA).

Mausmodell der Middle Cerebral Artery (MCA) Okklusion und Rekanalisation:

In diesem Projekt wird eine neuartige Methode der transienten photothrombotischen distalen MCA-Okklusion, die von unserer Gruppe entwickelt wurde, angewendet. Kurz gesagt wird die photothrombotische MCA-Okklusion durchgeführt, indem die distale MCA mit einem fokussierten grünen Laser bestrahlt wird, nach einer intraperitonealen Injektion des photosensitiven Farbstoffs Bengalrosa. Zu ausgewählten Zeiten nach MCA-Okklusion (30 min, 60 min, 90 min) wird die Rekanalisation durchgeführt, indem die okkludierte distale MCA mit einer Ultraviolett (UV)-LED bestrahlt wird, die in der Lage ist, die Fibrinbindungen innerhalb des Gerinnsels zu zerstören.

In-vivo-Zwei-Photonen-Bildgebung von Dendriten und Gefäßsystem:

Die strukturelle Plastizität von Axonen und Dendriten in der akuten Phase nach Schlaganfall im Vergleich zum Zustand vor dem Schlaganfall wird untersucht. Bei Thy1-GFP-Mäusen wird ein kraniales Fenster im peri-infarktären Bereich angelegt, um permanenten optischen Zugang zum Mauskortex zu ermöglichen. Die oberflächlichen Blutgefäße des kranialen Fensters werden als Landmarke verwendet, um dieselbe Region des Kortex in verschiedenen Bildgebungssitzungen wiederzufinden und eine longitudinale Untersuchung des Synapsenumsatzes und der Ausrichtung neuronaler Prozesse durchzuführen. Darüber hinaus wird die vaskuläre Permeabilität auf Kapillarebene charakterisiert. Zu diesem Zweck wird eine systemische Injektion eines Fluoreszenzfarbstoffs (z.B. Texas Red Dextran, Thermo Fisher Scientific, USA) in die Schwanzvene von Mäusen unmittelbar vor der Bildgebungssitzung durchgeführt. Dieser Farbstoff ist mehrere Stunden nach der Injektion vital und diffundiert nur dann und dort ins Parenchym, wo Extravasation auftritt. Dann werden Bildstapel der markierten Gefäße alle 5 Minuten von unmittelbar bis 30 Minuten nach Injektion aufgenommen. Um die Permeabilität von Blutgefäßen in vivo zu bewerten, werden die durchschnittlichen Fluoreszenzwerte innerhalb eines quadratischen Region of Interest, zentriert entweder innerhalb oder direkt außerhalb eines Blutgefäßes, gemessen und die Messung am selben Ort zu verschiedenen Zeitpunkten nach Injektion wiederholt. Die Permeabilität κ(t) wird gemäß der folgenden von Nhan 2013 beschriebenen Formel berechnet: [κ(t) = (dIe/dt)/[(Ii(t)/0.55)-(Ie(t)/(Ve/Vi)].

Ödem:

24 Stunden nach Schlaganfallinduktion wird der Hirnwassergehalt als indirektes Maß für zerebrales Ödem bei geopferten Mäusen gemäß Kenne und Mitarbeitern berechnet. Das Gehirn wird entlang der Mittellinie geteilt und das kontralaterale und ipsilaterale Gewebe wird direkt nach Entnahme gewogen, um das Feuchtgewicht (WW) zu erhalten. Die Gewebe werden bei 60°C für 72 Stunden getrocknet und gewogen, um das Trockengewicht (DW) zu erhalten. Der Wassergehalt wird als Prozentsatz des Feuchtgewichts berechnet; % Wassergehalt = [(WW-DW)/(WW)]*100.

Untersuchung zirkulierender Biomarker:

Um dieselben Blutbiomarker, die bei Patienten bewertet werden, zu verschiedenen Zeitpunkten (vor Schlaganfall, Baseline und 24 Stunden nach Okklusion) zu testen, wird Blut durch den retro-orbitalen Sinus bei anästhesierten Mäusen entnommen.

Statistische Analysen:

Die Stichprobe wird in drei experimentelle Gruppen (Sham, Nicht-Rekanalisiert und Rekanalisiert) eingeteilt. Für die Stichprobenplanung verwenden die Untersucher den ANOVA-Test (feste Effekte, omnibus, einweg) und die folgenden Daten: 3 experimentelle Gruppen, Effektstärke f = 0,5, α = 0,05, Power = 0,8 (verwendete Software G*Power, Version 3.1.9.2, Franz Faul, Universität Kiel, Deutschland). Daten von Mäusen der drei Gruppen werden zu verschiedenen Zeitpunkten (vor Schlaganfall, Baseline und 24 Stunden nach Schlaganfall) verglichen. Eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) mit wiederholten Messungen wird an Zwei-Photonen-Bildgebungsdaten durchgeführt, um den Synapsenumsatz und die Blut-Hirn-Schranken-Permeabilität kortikaler Blutgefäße zu verschiedenen Zeitpunkten zu bewerten. Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts angegeben.

Finanzierungen:

• Toskana-Region "Bando Salute 2018";
• #NEXTGENERATIONEU (NGEU) und finanziert vom Ministerium für Universität und Forschung (MUR), Nationaler Aufbau- und Resilienzplan (NRRP), Projekt MNESYS (PE0000006) - Ein multiskaliger integrierter Ansatz zur Untersuchung des Nervensystems in Gesundheit und Krankheit (DN. 1553 11.10.2022).