Mokré a suché biomarkery pro predikci sekundárního poškození při cévní mozkové příhodě: Od laboratoře k lůžku pacienta – Studie NIMBLE (NIMBLE)

POZADÍ Růst infarktu (IG), hemoragická transformace (HT) a mozkový edém (CE) jsou klíčovými faktory spojenými s negativním výsledkem u pacientů s ischemickou cévní mozkovou příhodou, navzdory úspěchu rekanalizace. Futile reperfuze a reperfuzní poškození jsou spojeny s těmito škodlivými jevy, ale jejich mechanismy zůstávají z velké části nepochopeny, a proto je obtížné je předvídat a zabránit jim. Různé studie ukázaly, že některé cirkulující biomarkery jsou spojeny s rozvojem IG, HT a CE.

Studie NIMBLE (Integrace nových neurozobrazovacích měření a cirkulujících biomarkerů pro predikci sekundárního poškození po cévní mozkové příhodě: od laboratoře k lůžku pacienta) je translativní projekt zahrnující klinický výzkum na lidech a experimentální studii na zvířatech. Jejím cílem je zkoumat možné faktory přispívající k IG, HT a CE po ischemii studiem cirkulujících biomarkerů ve vztahu k neurozobrazovacím abnormalitám a funkčnímu výsledku u lidí. U myší jsou cirkulující biomarkery studovány ve vztahu k neuronální reorganizaci na buněčné a subbuněčné úrovni a k experimentálnímu hodnocení CE.

KLINICKÉ PROSTŘEDÍ

Design studie:

Jednostředová, longitudinální, následná prospektivní observační studie zahrnující souvislou sérii pacientů s přední akutní ischemickou cévní mozkovou příhodou prezentovanou do 12 hodin od nástupu příznaků na pohotovostním oddělení, léčených nebo neléčených revaskularizačními terapiemi.

Všichni pacienti podstupují neurozobrazovací vyšetření a odběr krve pro stanovení několika sérových cirkulujících biomarkerů (viz níže podrobnosti).

Zařazování pacientů probíhalo od 24.4.2021 do 30.6.2023, celkem 213 pacientů, medián věku [IQR (interkvartilové rozpětí)] 80 [16] let, 46 % žen, medián výchozího NIHSS (National Institutes of Health Stroke Scale) [IQR] 10 [3].

Metodologie práce:

Klinické hodnocení:

Pro každého pacienta jsou zaznamenány kompletní klinické údaje včetně rizikových faktorů cévní mozkové příhody, léčby akutní cévní mozkové příhody a medikace před příhodou. Závažnost cévní mozkové příhody se měří pomocí NIHSS při vstupu a při sledování po 1, 7 a 90 dnech, a postižení po cévní mozkové příhodě pomocí modifikované Rankinovy škály (mRS) provedené po 3 měsících návštěvou nebo telefonickým rozhovorem.

Neuroradiologické hodnocení:

Neuroradiologické hodnocení je zaslepené vůči klinickým údajům. Zobrazení mozku zahrnuje vstupní nativní CT a, pokud je klinicky indikováno, vstupní CT (počítačová tomografie) vícefázovou angiografii a CT perfuzi. Provádí se CT po 24 hodinách a nativní MRI po 5 dnech (včetně sekvencí difuzně váženého zobrazení (DWI), zdánlivého difuzního koeficientu (ADC), tekutinou potlačené inverzní rekuperace (FLAIR) a rychlého gradientového echa (FFE)).

Rané ischemické známky (skóre Alberta Stroke Programme Early CT [ASPECTS]), přítomnost a závažnost onemocnění malých cév, přítomnost a stupeň CE a HT hodnotí dva neuroradiologové na vstupních a kontrolních CT snímcích.

CE je klasifikována podle kritérií SITS-ISTR (Safe Implementation of Treatments in Stroke - International Stroke Thrombolysis Register): COED1 = fokální otok mozku do jedné třetiny hemisféry, COED2 = fokální otok mozku větší než jedna třetina hemisféry, COED3 = otok mozku s posunem střední čáry, NONE = absence mozkového edému.

HT je hodnocena podle radiografické klasifikace ECASS (European Cooperative Acute Stroke Study): HI-1: Hemoragická infarkce typu 1 = drobné petechie HI-2: Hemoragická infarkce typu 2 = splývavější petechie PH-1: Parenchymové hematom typu 1 = <30 % infarktované oblasti s mírným prostor zaujímajícím efektem PH-2: Parenchymové hematom typu 2 = >30 % infarktované oblasti s významným prostor zaujímajícím efektem Perfuzní data odvozená podle místního klinického protokolu hodnotí expertní neuroradiolog k detekci objemu jádra infarktu a objemu hypoperfuze.

Dále se provádí MRI charakterizace edému k rozlišení vazogenního edému od cytotoxického edému analýzou signálových charakteristik a morfologie léze.

Aplikuje se také nová metoda pro kvantifikaci otoku mozku (vyvolaného CE a HT) a pro definici růstu léze a konečného objemu infarktu, nazvaná Anatomická distorze (AD). Dva expertní operátoři nezávisle vytvoří manuální mapování („masku“) ischemické léze viditelné na 24hodinovém CT snímku. Jeden operátor také definuje „masku“ léze na 5denním MRI (magnetická rezonance) snímku (pomocí sekvence DWI). Jakékoli neshody vyřeší samostatný neuroradiolog. Pro tento proces bude použit FSLeyes, software obsažený v softwaru FSL (FMRIB [Functional Magnetic Resonance Imaging of the Brain] Software Library v6.0, vytvořeno skupinou Analysis Group, FMRIB, Oxford, UK), který nabízí možnost generovat pro každého pacienta trojrozměrnou masku léze pokrývající infarktovou tkáň na všech CT řezech. Předchozí/neakutní ischemické léze (již přítomné na vstupním CT) nebudou do masek zahrnuty.

AD bude hodnocena porovnáním vstupního CT s 24hodinovým CT a 5denním MRI snímkem. Kroky potřebné k získání tohoto měření zahrnují vyznačení ischemické léze viditelné na kontrolních snímcích pomocí „masky“ (popsané výše) a registraci, proceduru, která umožňuje přesné porovnání různých snímků mozku, dokonce i v různých časech a u různých jedinců. AD lze vypočítat porovnáním dvou možných přístupů registrace a zejména kvantifikací rozdílu mezi maskami léze zpracovanými lineární a nelineární registrací podle metody popsané Harstonem v roce 2018. Veškeré zpracování a analýza obrazu bude provedena pomocí softwaru FSL (FMRIB Software Library v6.0, vytvořeno skupinou Analysis Group, FMRIB, Oxford, UK), volně přístupného softwaru vyvinutého výzkumnou skupinou University of Oxford. Odečtením AD od celkového objemu léze mohou vyšetřovatelé získat korigovaný objem infarktu.

Laboratorní protokol:

Měření biomarkerů je zaslepené vůči klinickým údajům. U všech pacientů se při příjmu a po 24 hodinách měří následující sérové hladiny biomarkerů spojených se zánětem, narušením hematoencefalické bariéry a reperfuzním poškozením.

Lze je rozdělit do tří skupin podle typu a rychlosti měřicí techniky:

• rychle dostupné molekuly: alfa 2 makroglobulin (A2M); sérový amyloidový A protein (SAA); Haptoglobin (Hp); vysoce senzitivní C-reaktivní protein (hsCRP); Neuron-specifická enoláza (NSE); S100Beta (S100B)
• biomarkery vyžadující delší dobu k měření: pro- a protizánětlivé cytokiny a chemokiny, matrixové metaloproteázy (MMPs) a jejich inhibitory (TIMPs), von Willebrandův faktor (vWF), markery endoteliální dysfunkce a těsné spojovací proteiny.
• Metabolomické a lipoproteinové biomarkery

Všechna data jsou zaznamenána do vyhrazeného formuláře Case report form (CRF).

Výsledná měření

Primární výsledné měření:

1. Růst infarktu, Hemoragická transformace a Mozkový edém

   Sekundární výsledné měření:

2. Funkční výsledek Funkční výsledek bude hodnocen měřením modifikované Rankinovy škály 3 měsíce po nástupu akutní ischemické cévní mozkové příhody.

Plán statistické analýzy:

Pro vyhodnocení asociace mezi každým primárním radiologickým výsledkem a vybranými vstupními proměnnými (včetně cirkulujících biomarkerů) budou provedeny univariátní lineární regresní analýzy. Nezávislé proměnné spojené s výsledkem v univariátní analýze budou zahrnuty do multivariačních modelů.

V další analýze budou vytvořeny univariátní logistické regresní modely pro posouzení asociace mezi vstupními cirkulujícími a radiologickými biomarkery a klinickými proměnnými a dichotomizovaným skóre mRS zaznamenaným po třech měsících. Rizikové faktory shledané významnými v univariátní analýze vstoupí do modelu vícenásobné logistické regrese s kritériem zpětné selekce.

PRECLINICKÉ PROSTŘEDÍ

Etické prohlášení preklinického výzkumu:

Všechny postupy týkající se myší jsou prováděny v souladu s předpisy italského ministerstva zdravotnictví, autorizace č. 723/2019.

Myši jsou chovány v průhledných plastových klecích pod 12hodinovým světelným/tmavým cyklem a mají volný přístup k vodě a potravě. Výzkumníci používají transgenní linii myší, C57BL/6J-Tg(Thy1-EGFP)MJrs/J, od Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine USA).

Myší model okluze a rekanalizace střední mozkové tepny (MCA):

V tomto projektu je aplikována nová metoda přechodné fototrombotické distální okluze MCA vyvinutá naší skupinou. Stručně řečeno, fototrombotická okluze MCA se provádí ozařováním distální MCA zaostřeným zeleným laserem po intraperitoneální injekci fotosenzitivního barviva Rose Bengal. V vybraných časech po okluzi MCA (30 min, 60 min, 90 min) se rekanalizace provádí ozařováním okludované distální MCA ultrafialovou (UV) LED diodou schopnou rozrušit fibrinní vazby uvnitř sraženiny.

In vivo dvoufotonová mikroskopie dendritů a vaskulatury:

Zkoumá se strukturální plasticita axonů a dendritů v akutní fázi po cévní mozkové příhodě ve srovnání se stavem před příhodou. U myší Thy1-GFP se provádí kraniální okno v periinfarktové oblasti, aby byl umožněn trvalý optický přístup do kůry myši. Povrchové krevní cévy kraniálního okna se používají jako orientační bod pro opětovné nalezení stejné oblasti kůry v různých zobrazovacích sezeních, což umožňuje longitudinální vyšetření obratu synaptických zakončení a orientace neuronálních procesů. Navíc je charakterizována vaskulární permeabilita na úrovni kapilár. K tomuto účelu se před zobrazovacím sezením provádí systémová injekce fluorescenčního barviva (např. Texas Red Dextran, Thermo Fisher Scientific, USA) do kaudální žíly myší. Toto barvivo je vitální několik hodin po injekci a difunduje do parenchymu pouze tehdy a tam, kde dojde k extravazaci. Poté se získávají zobrazovací zásobníky označené vaskulatury každých 5 minut od okamžiku do 30 minut po injekci. Pro vyhodnocení permeability krevních cév in vivo se provádí průměrné hodnoty fluorescence v čtvercové oblasti zájmu (Region of Interest) umístěné buď uvnitř, nebo těsně mimo krevní cévu, a měření se opakuje na stejném místě v různých časových bodech po injekci. Permeabilita κ(t) bude vypočítána podle následujícího vzorce popsaného Nhanem v roce 2013: [κ(t) = (dIe/dt)/[(Ii(t)/0.55)-(Ie(t)/(Ve/Vi)].

Edém:

24 hodin po indukci cévní mozkové příhody se u usmrcených myší vypočítá obsah vody v mozku jako nepřímé měření mozkového edému podle Kenneho a spolupracovníků. Mozek se rozdělí podél střední čáry a kontralaterální a ipsilaterální tkáně se zváží ihned po odstranění, aby se získala vlhká hmotnost (WW). Tkáně se suší při 60 °C po dobu 72 hodin a váží se, aby se získala suchá hmotnost (DW). Obsah vody se vypočítá jako procento vlhké hmotnosti; % obsahu vody = [(WW-DW)/(WW)]*100.

Zkoumání cirkulujících biomarkerů:

Za účelem testování stejných krevních biomarkerů hodnocených u pacientů v různých časových bodech (před cévní mozkovou příhodou, při vstupu a 24 hodin po okluzi) se odebírá krev z retro-orbitálního sinu u anestetizovaných myší.

Statistické analýzy:

Vzorek bude rozdělen do tří experimentálních skupin (Sham, No-Recanalized, a Recanalized). Pro stanovení velikosti vzorku výzkumníci použijí ANOVA test (fixed effects, omnibus, one-way) a následující data: 3 experimentální skupiny, velikost účinku f = 0,5, α = 0,05, Síla = 0,8 (použitý software G * Power, verze 3.1.9.2, Franz Faul, University of Kiel, Německo). Data myší ze tří skupin budou porovnána v různých časových bodech (před cévní mozkovou příhodou, při vstupu a 24 hodin po cévní mozkové příhodě). Na dvoufotonových zobrazovacích datech bude provedena jednosměrná analýza rozptylu (ANOVA) s opakovanými měřeními za účelem posouzení synaptického obratu a permeability hematoencefalické bariéry kortikálních krevních cév v různých časových bodech. Data budou uvedena jako průměr ± standardní chyba průměru.

Financování:

• Toskánský region "Bando Salute 2018";
• #NEXTGENERATIONEU (NGEU) a financováno Ministerstvem univerzit a výzkumu (MUR), Národním plánem obnovy a odolnosti (NRRP), projekt MNESYS (PE0000006) - Multiměřítkový integrovaný přístup ke studiu nervového systému ve zdraví a nemoci (DN. 1553 11.10.2022).