Biomarcadores húmedos y secos para predecir lesiones secundarias en el ictus: del laboratorio a la cabecera del paciente - El estudio NIMBLE (NIMBLE)

ANTECEDENTES El crecimiento del infarto (IG), la transformación hemorrágica (HT) y el edema cerebral (CE) son factores clave asociados con un resultado negativo en pacientes con ictus isquémico, a pesar del éxito de la recanalización. La reperfusión inútil y la lesión por reperfusión están vinculadas a estos fenómenos perjudiciales, pero sus mecanismos siguen siendo en gran medida desconocidos y, en consecuencia, son difíciles de predecir y de impedir. Varios estudios han demostrado que algunos biomarcadores circulantes están asociados con el desarrollo de IG, HT y CE.

El estudio NIMBLE (Integrating novel NeuroImaging Measurements and circulating Biomarkers for the prediction of secondary injury foLlowing strokE: from bench to bedside) es un proyecto traslacional que incluye investigación clínica en humanos y estudio experimental en animales. Tiene como objetivo investigar posibles factores que contribuyen al IG, HT y CE tras la isquemia, mediante el estudio de biomarcadores circulantes en relación con las anomalías de neuroimagen y el resultado funcional en humanos. En ratones, se estudian los biomarcadores circulantes en relación con la reorganización neuronal a nivel celular y subcelular y con la evaluación experimental del CE.

CONTEXTO CLÍNICO

Diseño del estudio:

Estudio observacional prospectivo longitudinal de seguimiento, unicéntrico, que incluye una serie consecutiva de pacientes con ictus isquémico agudo anterior que se presentan en el Servicio de Urgencias dentro de las 12 horas desde el inicio de los síntomas, tratados o no tratados con terapias de revascularización.

Todos los pacientes se someten a una evaluación de neuroimagen y a una extracción de sangre para la dosificación de varios biomarcadores séricos circulantes (ver detalles a continuación).

El reclutamiento de pacientes se realizó entre el 24/04/2021 y el 30/06/2023, con un total de 213 pacientes, edad media [Rango Intercuartílico (RIC)] de 80 [16] años, 46% mujeres, NIHSS (Escala de Ictus de los Institutos Nacionales de Salud) basal media [RIC] de 10 [3].

Metodología de trabajo:

Evaluación clínica:

Para cada paciente se registra un conjunto completo de datos clínicos, incluidos los factores de riesgo de ictus, el tratamiento agudo del ictus y la medicación previa al ictus. La gravedad del ictus se mide utilizando el NIHSS al inicio y en los seguimientos a 1, 7 y 90 días, y la discapacidad post-ictus mediante la escala de Rankin modificada (mRS) administrada a los 3 meses mediante visita o entrevista telefónica.

Evaluación neurorradiológica:

La evaluación neurorradiológica se realiza de forma ciega a los datos clínicos. La neuroimagen cerebral incluye una TC simple basal y, cuando está clínicamente indicado, angiografía por TC multifásica y perfusión por TC al inicio. Se realizan una TC a las 24 h y una RM sin contraste a los 5 días (incluyendo secuencias de imagen ponderada por difusión (DWI), coeficiente de difusión aparente (ADC), recuperación de la inversión atenuada por líquido (FLAIR) y eco de campo rápido (FFE)).

Los signos isquémicos precoces (puntuación ASPECTS [Alberta Stroke Programme Early CT]), la presencia y gravedad de la enfermedad de pequeño vaso, la presencia y grado de CE y HT son evaluados por dos neurorradiólogos en las TC basales y de seguimiento.

El CE se clasifica según los criterios SITS-ISTR (Safe Implementation of Treatments in Stroke - International Stroke Thrombolysis Register):

COED1 = hinchazón cerebral focal de hasta un tercio del hemisferio, COED2 = hinchazón cerebral focal de más de un tercio del hemisferio, COED3 = hinchazón cerebral con desplazamiento de la línea media, NONE = ausencia de edema cerebral.

La HT se evalúa según la clasificación radiográfica ECASS (European Cooperative Acute Stroke Study):

HI-1: Infarto hemorrágico tipo 1 = pequeñas petequias HI-2: Infarto hemorrágico tipo 2 = petequias más confluentes PH-1: Hematoma parenquimatoso tipo 1 = <30% del área infartada con efecto ocupante de espacio leve PH-2: Hematoma parenquimatoso tipo 2 = >30% del área infartada con efecto ocupante de espacio significativo Los datos de perfusión derivados según el protocolo clínico local son evaluados por un neurorradiólogo experto para detectar el núcleo del infarto y los volúmenes de hipoperfusión.

Además, se realiza una caracterización del edema mediante RM para diferenciar el edema vasogénico del edema citotóxico, analizando las características de la señal y la morfología de la lesión.

También se aplica un nuevo método para cuantificar la hinchazón cerebral (inducida por CE y HT) y definir el crecimiento de la lesión y el volumen final del infarto, llamado Distorsión Anatómica (AD).

Dos operadores expertos crearán de forma independiente un mapeo manual ("máscara") de la lesión isquémica visible en la TC de 24 horas. Un operador también definirá una "máscara" de la lesión en la RM (Imagen por Resonancia Magnética) de 5 días (utilizando la secuencia DWI). Cualquier discrepancia será resuelta por un neurorradiólogo aparte. Para este proceso, se utilizará FSLeyes, un software incluido en el software FSL (FMRIB [Functional Magnetic Resonance Imaging of the Brain] Software Library v6.0, creado por el Analysis Group, FMRIB, Oxford, Reino Unido) que ofrece la posibilidad de generar una máscara de lesión tridimensional para cada paciente, cubriendo el tejido infartado en todas las secciones de TC. Las lesiones isquémicas previas/no agudas (ya presentes en la TC basal) no se incluirán en las máscaras.

La AD se evaluará comparando la TC basal con las TC de 24 horas y las RM de 5 días. Los pasos necesarios para obtener esta medida incluyen delinear la lesión isquémica visible en las exploraciones de seguimiento utilizando una "máscara" (descrita anteriormente) y el registro, un procedimiento que permite una comparación precisa entre diferentes imágenes del cerebro, incluso en diferentes momentos y en diferentes individuos. La AD puede calcularse comparando los dos enfoques de registro posibles y, en particular, cuantificando la diferencia entre las máscaras de lesión procesadas mediante registro Lineal y No Lineal según el método descrito por Harston en 2018. Todo el procesamiento y análisis de imágenes se realizará utilizando el software FSL (FMRIB Software Library v6.0, creado por el Analysis Group, FMRIB, Oxford, Reino Unido), un software de acceso libre desarrollado por un grupo de investigación de la Universidad de Oxford. Restando la AD del volumen total de la lesión, los investigadores pueden obtener el volumen del infarto corregido.

Protocolo de laboratorio:

La medición de biomarcadores se realiza de forma ciega a los datos clínicos. En todos los pacientes se miden, a la llegada y tras 24 horas, los siguientes niveles séricos de biomarcadores vinculados a la inflamación, la disrupción de la barrera hematoencefálica y la lesión por reperfusión.

Pueden dividirse en tres grupos según el tipo y la velocidad de la técnica de medición:

• moléculas de disponibilidad rápida: alfa 2 macroglobulina (A2M); Proteína sérica amiloide A (SAA); Haptoglobina (Hp); Proteína C reactiva de alta sensibilidad (hsCRP); Enolasa específica de neurona (NSE); S100Beta (S100B)
• biomarcadores que requieren tiempos más largos para medirse: citocinas y quimiocinas pro- y antiinflamatorias, metaloproteasas de matriz (MMPs) y sus inhibidores (TIMPs), factor de von Willebrand (vWF), marcadores de disfunción endotelial y proteínas de unión estrecha.
• biomarcadores metabolómicos y lipoproteómicos

Todos los datos se registran en un Formulario de informe de caso (CRF) dedicado.

Medida de resultado

Medida de resultado primaria:

1. Crecimiento del infarto, Transformación Hemorrágica y Edema Cerebral

   Medida de resultado secundaria:

2. Resultado funcional El resultado funcional se evaluará midiendo la escala de Rankin modificada 3 meses después del inicio del ictus isquémico agudo.

Plan de análisis estadístico:

Se realizarán análisis de regresión lineal univariante para evaluar la asociación entre cada resultado radiológico primario y variables basales seleccionadas (incluyendo biomarcadores circulantes). Las variables independientes asociadas con el resultado en el análisis univariante se incluirán en modelos multivariantes.

En otro análisis, se crearán modelos de regresión logística univariante para evaluar la asociación entre los biomarcadores circulantes y radiológicos basales y las variables clínicas y la puntuación mRS dicotomizada registrada a los tres meses. Los factores de riesgo que resulten significativos en un análisis univariante entrarán en un modelo de regresión logística múltiple con un criterio de selección hacia atrás.

CONTEXTO PRECLÍNICO

Declaración ética de la investigación preclínica:

Todos los procedimientos que involucran ratones se realizan de acuerdo con las regulaciones de la autorización n. 723/2019 del Ministerio de Salud italiano.

Los ratones se alojan en jaulas de plástico transparente bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h y tienen acceso ad libitum a agua y comida. Los investigadores utilizan una línea de ratones transgénicos, C57BL/6J-Tg(Thy1-EGFP)MJrs/J, de Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine, EE. UU.).

Modelo de ratón de oclusión y recanalización de la Arteria Cerebral Media (MCA):

En este proyecto, se aplica un nuevo método de oclusión fototrombótica transitoria de la MCA distal desarrollado por nuestro grupo. Brevemente, la oclusión fototrombótica de la MCA se realiza irradiando la MCA distal con un láser verde enfocado, tras una inyección intraperitoneal del colorante fotosensible Rosa de Bengala. En tiempos seleccionados tras la oclusión de la MCA (30 min, 60 min, 90 min), la recanalización se realiza irradiando la MCA distal ocluida con un LED ultravioleta (UV) capaz de romper los enlaces de fibrina dentro del coágulo.

Imagen in vivo de dos fotones de dendritas y vasculatura:

Se investiga la plasticidad estructural de axones y dendritas en la fase aguda tras el ictus en comparación con la condición pre-ictus. En ratones Thy1-GFP, se realiza una ventana craneal en el área peri-infarto para permitir un acceso óptico permanente a la corteza del ratón. Los vasos sanguíneos superficiales de la ventana craneal se utilizan como referencia para rastrear la misma región de la corteza en diferentes sesiones de imagen, realizando una investigación longitudinal de la renovación de terminales sinápticos y la orientación de los procesos neuronales. Además, se caracteriza la permeabilidad vascular a nivel capilar. Con este fin, se realiza una inyección sistémica de un colorante fluorescente (p. ej., Dextrano Texas Red, Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) en la vena caudal de los ratones justo antes de la sesión de imagen. Este colorante es vital durante varias horas después de la inyección y solo se difunde al parénquima si y donde ocurre extravasación. Luego, se adquieren pilas de imagen de la vasculatura marcada cada 5 minutos desde inmediatamente hasta 30 minutos después de la inyección. Para evaluar la permeabilidad de los vasos sanguíneos in vivo, se realizan los valores promedio de fluorescencia dentro de una Región de Interés cuadrada centrada ya sea dentro o justo fuera de un vaso sanguíneo y se repite la medida en la misma ubicación en diferentes puntos temporales después de la inyección. La permeabilidad κ(t) se calculará según la siguiente fórmula descrita por Nhan en 2013: [κ(t) = (dIe/dt)/[(Ii(t)/0.55)-(Ie(t)/(Ve/Vi)].

Edema:

24 horas después de la inducción del ictus, se calcula el contenido de agua cerebral, como medida indirecta del edema cerebral, en ratones sacrificados, según Kenne y colaboradores. El cerebro se divide por la línea media y los tejidos contralateral e ipsilateral se pesan inmediatamente después de la extracción para obtener el peso húmedo (WW). Los tejidos se secan a 60°C durante 72 horas y se pesan para obtener el peso seco (DW). El contenido de agua se calcula como un porcentaje del peso húmedo; % contenido de agua = [(WW-DW)/(WW)]*100.

Investigación de biomarcadores circulantes:

Para evaluar en diferentes puntos temporales (pre-ictus, basal y 24 horas después de la oclusión) los mismos biomarcadores sanguíneos evaluados en pacientes, se extrae sangre a través del seno retro-orbital en ratones anestesiados.

Análisis estadísticos:

La muestra se dividirá en tres grupos experimentales (Sham, No Recanalizado y Recanalizado). Para el tamaño de la muestra, los investigadores utilizarán la prueba ANOVA (efectos fijos, omnibus, unidireccional) y los siguientes datos: 3 grupos experimentales, tamaño del efecto f = 0.5, α = 0.05, Potencia = 0.8 (software utilizado G*Power, versión 3.1.9.2, Franz Faul, Universidad de Kiel, Alemania). Los datos de los ratones de los tres grupos se compararán en diferentes puntos temporales (pre-ictus, basal y 24 horas después del ictus). Se realizará un análisis de varianza (ANOVA) de medidas repetidas unidireccional en los datos de imagen de dos fotones para evaluar la renovación sináptica y la permeabilidad de la barrera hematoencefálica de los vasos sanguíneos corticales en diferentes puntos temporales. Los datos se presentarán como media ± error estándar de la media.

Financiación:

• Región de Toscana "Bando Salute 2018";
• #NEXTGENERATIONEU (NGEU) y financiado por el Ministerio de Universidad e Investigación (MUR), Plan Nacional de Recuperación y Resiliencia (PNRR), proyecto MNESYS (PE0000006) - Un enfoque integrado multiescala para el estudio del sistema nervioso en salud y enfermedad (DN. 1553 11.10.2022).