Våte og tørre biomarkører for å forutsi sekundærskade ved hjerneslag: Fra laboratoriet til sengekanten - NIMBLE-studien (NIMBLE)

BAKGRUNN Infarktvekst (IG), hemoragisk transformasjon (HT) og cerebral ødem (CE) er nøkkelfaktorer knyttet til en negativ utkomst hos pasienter med iskemisk slag, til tross for suksessen med rekanalisering. Forspilt reperfusjon og reperfusjonsskade er knyttet til disse skadelige fenomenene, men mekanismene deres forblir stort sett uforståtte og følgelig er de vanskelige å forutsi og hindre. Forskjellige studier har vist at noen sirkulerende biomarkører er assosiert med utviklingen av IG, HT og CE.

NIMBLE-studien (Integrating novel NeuroImaging Measurements and circulating Biomarkers for the prediction of secondary injury foLlowing strokE: from bench to bedside) er et translasjonelt prosjekt som inkluderer klinisk forskning på mennesker og eksperimentell studie på dyr. Den har som mål å undersøke mulige faktorer som bidrar til IG, HT og CE etter iskemi ved å studere sirkulerende biomarkører i forhold til nevroavbildningsavvik og funksjonell utkomst hos mennesker. I mus studeres sirkulerende biomarkører i forhold til nevronal reorganisering på cellulært og subcellulært nivå og til eksperimentell evaluering av CE.

KLINISK OMGIVELSE

Studiedesign:

Enkelt-senter, longitudinell, oppfølgingsprospektiv observasjonsstudie som inkluderer en påfølgende serie pasienter med akutt anteriort iskemisk slag som presenterer seg innen 12 timer fra symptomdebut på akuttmottaket, enten behandlet eller ikke behandlet med revaskulariseringsterapier.

Alle pasienter gjennomgår nevroavbildningsevaluering og blodprøvetaking for dosering av flere serum-sirkulerende biomarkører (se nedenfor for detaljer).

Pasientrekruttering var mellom 24.04.2021 og 30.06.2023 for totalt 213 pasienter, medianalder [IQR (interkvartilområde)] 80 [16] år, 46% kvinner, median baseline NIHSS (National Institutes of Health Stroke Scale) [IQR] 10 [3]

Arbeidsmetodikk:

Klinisk vurdering:

Et fullt spekter av kliniske data inkludert slagrisikofaktorer, akutt slagbehandling, pre-slag-medikamenter registreres for hver pasient. Slagalvorlighet måles ved hjelp av NIHSS ved baseline og ved 1, 7 og 90 dagers oppfølging, og post-slag-funksjonshemning ved den modifiserte Rankin-skalaen (mRS) administrert ved 3 måneder ved besøk eller telefonintervju.

Neuroradiologisk evaluering:

Neuroradiologisk evaluering er blindet for kliniske data. Hjerneavbildning inkluderer baseline vanlig CT, og, når klinisk indikert, CT (computertomografi) flerfaseangiografi og CT-perfusjon ved baseline. CT ved 24 timer, og ikke-kontrast MRI ved 5 dager (inkludert diffusjonsvektet bilde (DWI), tilsynelatende diffusionskoeffisient (ADC), fluid-attenuated inversion recovery (FLAIR) og fast field echo (FFE) sekvenser) utføres.

Tidlige iskemiske tegn (Alberta Stroke Programme Early CT [ASPECTS]-score), tilstedeværelse og alvorlighetsgrad av småkarssykdom, tilstedeværelse og gradering av CE og HT vurderes av to neuroradiologer ved baseline og oppfølgings-CT-skanninger.

CE klassifiseres i henhold til SITS-ISTR-kriteriene (Safe Implementation of Treatments in Stroke - International Stroke Thrombolysis Register):

COED1 = fokal hjernesvulst opp til en tredjedel av hemisfæren, COED2 = fokal hjernesvulst større enn en tredjedel av hemisfæren, COED3 = hjernesvulst med midtlinjeforskyvning, NONE = fravær av cerebral ødem.

HT vurderes i henhold til ECASS-radiografisk klassifisering (European Cooperative Acute Stroke Study):

HI-1: Hemoragisk infarkt type 1 = små petekkier HI-2: Hemoragisk infarkt type 2 = mer konfluerende petekkier PH-1: Parenkymatøst hematom type 1 = <30% av infarktområdet med mild plassokkuperende effekt PH-2: Parenkymatøst hematom type 2 = >30% av infarktområdet med betydelig plassokkuperende effekt Perfusjonsdata avledet etter lokal klinisk protokoll evalueres av en ekspert neuroradiolog for å oppdage infarktkjerne og hypoperfusjonsvolumer.

Videre utføres en MRI-karakterisering av ødemet for å differensiere vasogent ødem fra cytotoksisk ødem ved å analysere signalegenskapene og lesjonsmorfologien.

En ny metode for å kvantifisere hjernesvulst (indusert av CE og HT) og for å definere lesjonsvekst og endelig infarktvolum, kalt Anatomical Distortion (AD), anvendes også.

To ekspertoperatører vil uavhengig lage en manuell kartlegging ("maske") av den iskemiske lesjonen synlig på 24-timers CT-skanningen. En lesjons"maske" vil bli definert av en operatør også på 5 dagers MRI (Magnetic Resonance Imaging)-skanningen (ved bruk av DWI-sekvens). Eventuelle avvik vil bli løst av en separat neuroradiolog. For denne prosessen vil FSLeyes brukes, en programvare inkludert i FSL-programvaren (FMRIB [Functional Magnetic Resonance Imaging of the Brain] Software Library v6.0, Created by the Analysis Group, FMRIB, Oxford, UK) som tilbyr muligheten til å generere en tredimensjonal lesjonsmaske for hver pasient, som dekker infarktvevet på alle CT-seksjoner. Tidligere/ikke-akutt iskemiske lesjoner (allerede tilstede på baseline CT) vil ikke inkluderes i maskene.

AD vil bli vurdert ved å sammenligne baseline CT med 24-timers CT og 5 dagers MRI-skanninger. Trinnene som kreves for å oppnå denne målingen inkluderer å avgrense den iskemiske lesjonen synlig på oppfølgingsskanninger ved hjelp av en "maske" (beskrevet før) og registrering, en prosedyre som muliggjør nøyaktig sammenligning mellom forskjellige bilder av hjernen, selv på forskjellige tidspunkter og individer. AD kan beregnes ved å sammenligne de to mulige registreringsmetodene og spesielt ved å kvantifisere forskjellen mellom lesjonsmaskene behandlet gjennom lineær og ikke-lineær registrering i henhold til metoden beskrevet av Harston i 2018. All bildebehandling og -analyse vil bli utført ved bruk av FSL-programvare (FMRIB Software Library v6.0, Created by the Analysis Group, FMRIB, Oxford, UK), en fritt tilgjengelig programvare utviklet av en forskningsgruppe ved University of Oxford. Ved å trekke fra AD fra totalt lesjonsvolum kan forskerne oppnå det korrigerte infarktvolumet.

Laboratorieprotokoll:

Biomarkørmålinger er blindet for kliniske data. I alle pasienter måles følgende serum-nivåer av biomarkører knyttet til betennelse, blod-hjerne-barriere-svikt og reperfusjonsskade ved ankomst og etter 24 timer.

De kan deles inn i tre grupper i henhold til type og hastighet på måleteknikken:

• raskt tilgjengelige molekyler: alfa 2 makroglobulin (A2M); Serum amyloid A protein (SAA); Haptoglobin (Hp); høyfølsomt C-reaktivt protein (hsCRP); Nevronspesifisk enolase (NSE); S100Beta (S100B)
• biomarkører som krever lengre tid for å måles: pro- og anti-inflammatoriske cytokiner og kjemokiner, matriksmetalloproteaser (MMPs) og deres inhibitorer (TIMPs), von Willebrand-faktor (vWF), endoteldysfunksjonsmarkører og tette forbindelsesproteiner.
• Metabolomiske og lipoproteomiske biomarkører

Alle data rapporteres i en dedikert Case report form (CRF).

Utfallsmål

Primært utfallsmål:

1. Infarktvekst, hemoragisk transformasjon og cerebral ødem

   Sekundært utfallsmål:

2. Funksjonell utkomst Funksjonell utkomst vil bli vurdert ved å måle den modifiserte Rankin-skalaen 3 måneder etter akutt iskemisk slagdebut.

Statistisk analyseplan:

Univariate lineære regresjonsanalyser vil bli utført for å evaluere sammenhengen mellom hvert primært radiologisk utfall og utvalgte baseline-variabler (inkludert sirkulerende biomarkører). Uavhengige variabler assosiert med utfallet ved univariat analyse vil inkluderes i multivariate modeller.

I en annen analyse vil univariate logistiske regresjonsmodeller bli opprettet for å vurdere sammenhengen mellom baseline sirkulerende og radiologiske biomarkører og kliniske variabler og den dikotomiserte mRS-scoren registrert ved tre måneder. Risikofaktorene funnet signifikante i en univariat analyse vil gå inn i en multipl logistisk regresjonsmodell med et baklengs utvalgskriterium.

PREKLINISK OMGIVELSE

Etisk erklæring preklinisk forskning:

Alle prosedyrer som involverer mus utføres i samsvar med forskrifter fra det italienske helseministeriet autorisasjon nr. 723/2019.

Mus huses i gjennomsiktige plastbokser under en 12-timers lys/mørk-syklus og har ad libitum tilgang til vann og mat. Forskerne bruker en transgen muslinje, C57BL/6J-Tg(Thy1-EGFP)MJrs/J, fra Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine USA).

Musemodell for Middle Cerebral Artery (MCA)-okklusjon og rekanalisering:

I dette prosjektet anvendes en ny metode for transient fototrombotisk distal MCA-okklusjon utviklet av vår gruppe. Kort fortalt utføres fototrombotisk MCA-okklusjon ved å bestråle den distale MCA med en fokusert grønn laser, etter en intraperitoneal injeksjon av den fotosensitive fargen Rose Bengal. Ved utvalgte tider etter MCA-okklusjon (30 min, 60 min, 90 min) utføres rekanalisering ved å bestråle den okkluderte distale MCA med en ultrafiolett (UV) LED som er i stand til å bryte fibrinbindingene inne i blodproppen.

In vivo to-foton avbildning av dendritter og vaskulatur:

Den strukturelle plastisiteten til aksoner og dendritter i den akutte fasen etter slag sammenlignet med pre-slag-tilstand undersøkes. I Thy1-GFP-mus utføres et kranievindu på peri-infarktområdet for å tillate permanent optisk tilgang til musekortexen. De overfladiske blodkarene i kranievinduet brukes som et landemerke for å gjenfinne samme region av cortexen i forskjellige avbildningsøkter som utfører en longitudinell undersøkelse av synaptisk terminal omsetning og nevronale prosessers orientering. Dessuten karakteriseres vaskulær permeabilitet på kapillærnivå. For dette formålet utføres en systemisk injeksjon av en fluorescerende farge (f.eks. Texas Red Dextran, Thermo Fisher Scientific, USA) i halvenen på mus rett før avbildningsøkten. Denne fargen er vital i flere timer etter injeksjonen og diffunderer inn i parenkymet bare hvis og hvor ekstravasasjon oppstår. Deretter samles avbildningsstabler av det merket vaskulaturet hvert 5. minutt fra umiddelbart til 30 minutter etter injeksjon. For å evaluere permeabiliteten til blodkar in vivo utføres de gjennomsnittlige fluorescensverdiene innenfor et kvadratisk region of interest sentrert enten inne eller rett utenfor et blodkar og gjentas målingen på samme sted på forskjellige tidspunkter etter injeksjon. Permeabiliteten κ(t) vil bli beregnet i henhold til følgende formel beskrevet av Nhan i 2013: [κ(t) = (dIe/dt)/[(Ii(t)/0.55)-(Ie(t)/(Ve/Vi)].

Ødem:

24 timer etter slaginduksjon beregnes hjernevanninnholdet, som et indirekte mål på cerebral ødem, i ofrede mus, i henhold til Kenne og samarbeidspartnere. Hjernen deles langs midtlinjen og de kontralaterale og ipsilaterale vevene veies rett etter fjerning for å oppnå våtvekt (WW). Vevene tørkes ved 60°C i 72 timer og veies for å oppnå tørrvekt (DW). Vanninnhold beregnes som en prosentandel av våtvekt; % vanninnhold = [(WW-DW)/(WW)]*100.

Sirkulerende biomarkørers undersøkelse:

For å teste de samme blodbiomarkørene evaluert i pasienter på forskjellige tidspunkter (pre-slag, baseline og 24 timer etter okklusjonen) tas blod gjennom den retro-orbitale sinusen i anestiserte mus.

Statistiske analyser:

Utvalget vil deles inn i tre eksperimentelle grupper (Sham, Ikke-Rekanalisert og Rekanalisert). For utvalgsstørrelsen vil forskerne bruke ANOVA-testen (faste effekter, omnibus, enveis) og følgende data: 3 eksperimentelle grupper, effektstørrelse f = 0,5, α = 0,05, Power = 0,8 (programvare brukt G * Power, versjon 3.1.9.2, Franz Faul, University of Kiel, Tyskland). Data fra mus i de tre gruppene vil bli sammenlignet på forskjellige tidspunkter (pre-slag, baseline og 24 etter slag). En enveis variansanalyse (ANOVA) med gjentatte mål vil bli utført på to-foton avbildningsdata for å vurdere den synaptiske omsetningen og blod-hjerne-barriere-permeabiliteten til kortikale blodkar på forskjellige tidspunkter. Data vil gis som gjennomsnitt ± standardfeil av gjennomsnittet.

Finansiering:

• Toscana-regionen "Bando Salute 2018";
• #NEXTGENERATIONEU (NGEU) og finansiert av Ministeriet for universitet og forskning (MUR), National Recovery and Resilience Plan (NRRP), prosjekt MNESYS (PE0000006) - A Multiscale integrated approach to the study of the nervous system in health and disease (DN. 1553 11.10.2022).