预测脑卒中继发性损伤的湿性和干性生物标志物：从实验室到临床——NIMBLE研究 (NIMBLE)

背景 尽管再通治疗取得了成功，但梗死进展（IG）、出血性转化（HT）和脑水肿（CE）是与缺血性卒中患者不良结局相关的关键因素。无效再灌注和再灌注损伤与这些有害现象有关，但其机制在很大程度上仍未明了，因此难以预测和阻止。多项研究表明，一些循环生物标志物与IG、HT和CE的发生发展相关。

NIMBLE研究（整合新型神经影像学测量与循环生物标志物以预测卒中后继发性损伤：从基础到临床）是一个转化项目，包括人体临床研究和动物实验研究。其目的是通过研究循环生物标志物与神经影像学异常及人体功能结局的关系，探讨缺血后IG、HT和CE的可能影响因素。在小鼠中，循环生物标志物的研究侧重于细胞和亚细胞水平的神经元重组以及CE的实验评估。

临床环境

研究设计：

单中心、纵向、随访性前瞻性观察研究，纳入一系列连续的患者，这些患者为前循环急性缺血性卒中，症状出现后12小时内就诊于急诊科，无论是否接受血管再通治疗。

所有患者均接受神经影像学评估，并采集血液用于测量多种血清循环生物标志物（详见下文）。

患者入组时间为2021年4月24日至2023年6月30日，共213例患者，中位年龄[四分位距（IQR）]为80[16]岁，46%为女性，基线美国国立卫生研究院卒中量表（NIHSS）中位评分[IQR]为10[3]。

工作方法：

临床评估：

为每位患者记录全面的临床数据，包括卒中危险因素、急性卒中治疗、卒中前用药。使用NIHSS在基线及随访第1、7、90天评估卒中严重程度，并通过改良Rankin量表（mRS）在3个月时通过访视或电话访谈评估卒中后残疾情况。

神经放射学评估：

神经放射学评估对临床数据设盲。脑成像包括基线平扫CT，以及临床指示时的基线CT多期相血管造影和CT灌注。在24小时进行CT检查，在第5天进行非增强MRI检查（包括弥散加权成像（DWI）、表观扩散系数（ADC）、液体衰减反转恢复（FLAIR）和快速场回波（FFE）序列）。

由两名神经放射科医师在基线和随访CT扫描中评估早期缺血征象（阿尔伯塔卒中项目早期CT评分[ASPECTS]）、小血管病的存在与严重程度、CE和HT的存在与分级。

CE根据SITS-ISTR（卒中治疗安全实施国际卒中溶栓登记）标准分类：COED1 = 局灶性脑肿胀达半球三分之一，COED2 = 局灶性脑肿胀超过半球三分之一，COED3 = 脑肿胀伴中线移位，NONE = 无脑水肿。

HT根据ECASS（欧洲急性卒中合作研究）影像学分类评估：HI-1：出血性梗死1型 = 小点状出血；HI-2：出血性梗死2型 = 更融合的点状出血；PH-1：脑实质血肿1型 = <30%梗死面积，轻度占位效应；PH-2：脑实质血肿2型 = >30%梗死面积，显著占位效应。根据当地临床方案获得的灌注数据由神经放射学专家评估，以检测梗死核心和低灌注体积。

此外，通过分析信号特征和病灶形态，进行MRI水肿表征以区分血管源性水肿和细胞毒性水肿。

还应用了一种称为解剖变形（AD）的新方法来量化脑肿胀（由CE和HT引起）并定义病灶进展和最终梗死体积。两名专家操作员将独立地在24小时CT扫描上创建缺血性病灶的手动映射（“掩模”）。一名操作员还将在第5天MRI扫描（使用DWI序列）上定义病灶“掩模”。任何差异将由另一名神经放射科医师解决。在此过程中，将使用FSLeyes软件（包含在FSL软件中，FMRIB软件库v6.0，由英国牛津FMRIB分析组创建），该软件可为每位患者生成三维病灶掩模，覆盖所有CT层面的梗死组织。基线CT上已存在的先前/非急性缺血性病灶将不包含在掩模中。

AD将通过比较基线CT与24小时CT和第5天MRI扫描来评估。获得此测量所需的步骤包括使用“掩模”（如前所述）描绘随访扫描上可见的缺血性病灶，以及配准，这是一种允许在不同时间和个体的大脑图像之间进行精确比较的程序。AD可以通过比较两种可能的配准方法来计算，特别是通过量化经过线性和非线性配准处理的病灶掩模之间的差异，具体方法依据Harston于2018年描述的方法。所有图像处理和分析将使用FSL软件（FMRIB软件库v6.0，由英国牛津大学研究组开发，免费访问软件）进行。通过从总病灶体积中减去AD，研究者可以获得校正后的梗死体积。

实验室方案：

生物标志物测量对临床数据设盲。在所有患者中，在到达时和24小时后测量与炎症、血脑屏障破坏和再灌注损伤相关的以下血清生物标志物水平。根据测量技术的类型和速度，它们可分为三组：

• 快速可用的分子：α2巨球蛋白（A2M）；血清淀粉样蛋白A（SAA）；触珠蛋白（Hp）；高敏C反应蛋白（hsCRP）；神经元特异性烯醇化酶（NSE）；S100β蛋白（S100B）。
• 需要较长时间测量的生物标志物：促炎和抗炎细胞因子及趋化因子、基质金属蛋白酶（MMPs）及其抑制剂（TIMPs）、血管性血友病因子（vWF）、内皮功能障碍标志物和紧密连接蛋白。
• 代谢组学和脂蛋白组学生物标志物。

所有数据均记录在专用的病例报告表（CRF）中。

结局指标

主要结局指标：

1. 梗死进展、出血性转化和脑水肿

   次要结局指标：

2. 功能结局 功能结局将通过测量急性缺血性卒中发病后3个月的改良Rankin量表来评估。

统计分析计划：

将进行单变量线性回归分析，以评估每个主要放射学结局与选定的基线变量（包括循环生物标志物）之间的关联。单变量分析中与结局相关的自变量将纳入多变量模型。

在另一项分析中，将创建单变量逻辑回归模型，以评估基线循环和放射学生物标志物及临床变量与三个月时记录的二分法mRS评分之间的关联。在单变量分析中发现显著的风险因素将进入采用向后选择标准的多重逻辑回归模型。

临床前环境

临床前研究伦理声明：

所有涉及小鼠的操作均按照意大利卫生部授权第723/2019号的规定进行。

小鼠饲养在透明塑料笼中，处于12小时光/暗周期，自由获取水和食物。研究者使用来自Jackson Laboratories（美国缅因州巴尔港）的转基因小鼠品系C57BL/6J-Tg(Thy1-EGFP)MJrs/J。

大脑中动脉（MCA）闭塞和再通的小鼠模型：

在本项目中，应用了我们团队开发的一种新型短暂光化学性远端MCA闭塞方法。简而言之，在腹腔注射光敏染料玫瑰红后，通过聚焦绿激光照射远端MCA进行光化学性MCA闭塞。在MCA闭塞后选定时间（30分钟、60分钟、90分钟），通过用能够破坏凝块内纤维蛋白键的紫外（UV）LED照射闭塞的远端MCA进行再通。

树突和脉管系统的体内双光子成像：

研究卒中后急性期与卒中前状态相比轴突和树突的结构可塑性。在Thy1-GFP小鼠中，在梗死周围区域进行颅骨开窗，以实现对小鼠皮层的永久光学访问。利用颅骨窗口的浅表血管作为地标，在不同成像会话中回溯皮层的同一区域，进行突触末端更替和神经元过程方向的纵向研究。此外，表征毛细血管水平的血管通透性。为此，在成像会话前立即在小鼠尾静脉进行全身注射荧光染料（例如，德克萨斯红葡聚糖，美国Thermo Fisher Scientific）。该染料在注射后数小时内保持活性，仅在发生外渗的部位扩散到实质中。然后，在注射后立即至30分钟内，每5分钟采集一次标记脉管系统的成像堆栈。为了评估体内血管通透性，在血管内或紧邻血管外部的方形感兴趣区域内计算平均荧光值，并在注射后不同时间点在同一位置重复测量。通透性κ(t)将根据Nhan于2013年描述的以下公式计算：[κ(t) = (dIe/dt)/[(Ii(t)/0.55)-(Ie(t)/(Ve/Vi)]。

水肿：

卒中诱导24小时后，根据Kenne及其合作者的方法，在处死的小鼠中计算脑水含量，作为脑水肿的间接测量。将大脑沿中线分开，立即称重对侧和同侧组织以获得湿重（WW）。将组织在60°C下干燥72小时并称重以获得干重（DW）。水含量按湿重百分比计算；%水含量 = [(WW-DW)/(WW)]*100。

循环生物标志物研究：

为了在不同时间点（卒中前、基线、闭塞后24小时）测试与患者中评估相同的血液生物标志物，在麻醉小鼠中通过眶后窦采血。

统计分析：

样本将分为三个实验组（假手术组、未再通组、再通组）。对于样本量计算，研究者将使用ANOVA检验（固定效应、综合性、单因素）和以下数据：3个实验组，效应大小f = 0.5，α = 0.05，功效 = 0.8（使用软件G*Power，版本3.1.9.2，Franz Faul，德国基尔大学）。将在不同时间点（卒中前、基线、卒中后24小时）比较三组小鼠的数据。将对双光子成像数据进行单因素重复测量方差分析（ANOVA），以评估不同时间点皮层血管的突触更替和血脑屏障通透性。数据将以平均值±标准误表示。

资金来源：

• 托斯卡纳大区“2018年健康招标”；
• #下一代欧盟（NGEU）并由大学与研究部（MUR）、国家复苏与韧性计划（NRRP）资助，项目MNESYS（PE0000006）——健康与疾病中神经系统的多尺度整合研究方法（DN. 1553 2022年10月11日）。