Märät ja kuivat biomarkkerit toissijaisen vaurion ennustamiseksi aivoinfarktissa: työpöydältä potilaan luo - NIMBLE-tutkimus (NIMBLE)

TAUSTA Infarktin kasvu (IG), hemorraginen transformaatio (HT) ja aivoödeema (CE) ovat keskeisiä tekijöitä, jotka liittyvät negatiiviseen lopputulokseen iskeemisessa aivohalvauksessa sairastuneilla potilailla, huolimatta resirkulaation onnistumisesta. Turha reperfuusio ja reperfuusiovamma liittyvät näihin haitallisiin ilmiöihin, mutta niiden mekanismit ovat suurelta osin ymmärtämättömiä ja siksi niitä on vaikea ennustaa ja estää. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että jotkut kiertävät biomarkkerit liittyvät IG:n, HT:n ja CE:n kehittymiseen.

NIMBLE-tutkimus (Uusien neurokuvantamismittauksien ja kiertävien biomarkkerien integrointi toissijaisen vaurion ennustamiseksi aivohalvauksen jälkeen: laboratoriosta potilaan luo) on translaatioprojekti, joka sisältää kliinistä tutkimusta ihmisissä ja kokeellista tutkimusta eläimissä. Sen tavoitteena on tutkia mahdollisia tekijöitä, jotka edesauttavat IG:n, HT:n ja CE:n kehittymistä iskemian jälkeen tutkimalla kiertäviä biomarkkereita suhteessa neurokuvantamisen poikkeamiin ja toiminnalliseen lopputulokseen ihmisissä. Hiirissä kiertäviä biomarkkereita tutkitaan suhteessa neuronien uudelleenjärjestäytymiseen solutasolla ja solualatasolla sekä CE:n kokeelliseen arviointiin.

KLIININEN ASETELMA

Tutkimuksen suunnittelu:

Yksikeskuksinen, pitkittäinen, seurantaan perustuva prospektiivinen havainnointitutkimus, johon rekrytoidaan peräkkäinen sarja potilaita, joilla on etummainen akuutti iskeeminen aivohalvaus ja jotka saapuvat hätäosastolle 12 tunnin kuluessa oireiden alkamisesta, olivatpa he sitten hoidettuja tai hoitamattomia revaskularisaatiohoidoilla.

Kaikki potilaat käyvät läpi neurokuvantamisen arvioinnin ja verinäytteenoton useiden seerumin kiertävien biomarkkerien annoksen määrittämiseksi (katso yksityiskohdat alta).

Potilaiden rekrytointi tapahtui 24.4.2021 ja 30.6.2023 välisenä aikana yhteensä 213 potilaalle, mediaani-ikä [IQR (interkvartiiliväli)] 80 [16] vuotta, 46 % naisia, mediaani perustason NIHSS (National Institutes of Health Stroke Scale) [IQR] 10 [3].

Työmenetelmä:

Kliininen arviointi:

Laaja kliininen aineisto, mukaan lukien aivohalvauksen riskitekijät, akuutti aivohalvaushoito ja ennen aivohalvausta käytetyt lääkkeet, tallennetaan jokaiselle potilaalle. Aivohalvauksen vakavuutta mitataan NIHSS:llä perustasolla sekä 1, 7 ja 90 päivän seurannassa, ja aivohalvauksen jälkeistä vammautumista mitataan muokatulla Rankin-asteikolla (mRS), joka suoritetaan 3 kuukauden kuluttua käynnillä tai puhelinhaastattelulla.

Neuroradiologinen arviointi:

Neuroradiologinen arviointi on sokeutettu kliiniselle aineistolle. Aivokuvantaminen sisältää perustason yksinkertaisen CT:n ja, kun kliinisesti aiheellista, CT (tietokonetomografia) monivaiheisen angiografian ja CT-perfuusion perustasolla. CT 24 tunnin kuluttua ja kontrastiton MRI 5 päivän kuluttua (mukaan lukien diffuusiolla painotettu kuvantaminen (DWI), näennäinen diffuusiokerroin (ADC), nestevaimennettu inversiovaimennus (FLAIR) ja nopea kenttäkaiku (FFE) sekvenssit) suoritetaan.

Varhaisia iskeemisia merkkejä (Alberta Stroke Programme Early CT [ASPECTS] -pisteet), pienaivosuonitautien esiintyminen ja vakavuus, CE:n ja HT:n esiintyminen ja luokittelu arvioidaan kahden neuroradiologin toimesta perustason ja seuranta-CT-kuvien perusteella.

CE luokitellaan SITS-ISTR (Safe Implementation of Treatments in Stroke - International Stroke Thrombolysis Register) -kriteerien mukaan:

COED1 = fokaalinen aivon turvotus enintään kolmasosaan pallopuoliskosta, COED2 = fokaalinen aivon turvotus yli kolmasosaan pallopuoliskosta, COED3 = aivon turvotus keskiviivan siirtymällä, NONE = aivoödeeman puuttuminen.

HT arvioidaan ECASS (European Cooperative Acute Stroke Study) -radiografisen luokituksen mukaan:

HI-1: Hemorraginen infarkti tyyppi 1 = pienet petekit HI-2: Hemorraginen infarkti tyyppi 2 = enemmän yhtenäisiä petekkejä PH-1: Parenkymaalisemaattoma tyyppi 1 = <30 % infarktoituneesta alueesta lievällä tilaa vievällä vaikutuksella PH-2: Parenkymaalisemaattoma tyyppi 2 = >30 % infarktoituneesta alueesta merkittävällä tilaa vievällä vaikutuksella Perfuusiodata, joka on johdettu paikallisen kliinisen protokollan mukaisesti, arvioidaan asiantuntija neuroradiologin toimesta infarktiytimen ja hypoperfuusion tilavuuksien havaitsemiseksi.

Lisäksi suoritetaan MRI-kuvauksen perusteella ödeeman karakterisointi erottaakseen vasogeeninen ödeema sytotoksiseksi ödeemaksi analysoimalla signaalin ominaisuuksia ja leesion morfologiaa.

Myös uutta menetelmää aivon turvotuksen (CE:n ja HT:n aiheuttaman) kvantifiointiin ja leesion kasvun sekä lopullisen infarktitilavuuden määrittämiseen, nimeltään Anatomical Distortion (AD), sovelletaan.

Kaksi asiantuntijaoperaattoria luo itsenäisesti manuaalisen kartoituksen ("maski") iskeemisestä leesionista, joka näkyy 24 tunnin CT-kuvassa. Yksi operaattori määrittelee leesion "maskin" myös 5 päivän MRI (Magnetic Resonance Imaging) -kuvasta (käyttäen DWI-sekvenssiä). Kaikki erimielisyydet ratkaistaan erillisen neuroradiologin toimesta. Tätä prosessia varten käytetään FSLeyes-ohjelmistoa, joka sisältyy FSL-ohjelmistoon (FMRIB [Functional Magnetic Resonance Imaging of the Brain] Software Library v6.0, Analysis Group, FMRIB, Oxford, UK), joka tarjoaa mahdollisuuden luoda kolmiulotteinen leesionmaski jokaiselle potilaalle kattamaan infarktikudos kaikilla CT-leikkauksilla. Aiemmat/ei-akuutit iskeemiset leesiot (jotka ovat jo perustason CT:ssä) eivät sisälly maskeihin.

AD arvioidaan vertaamalla perustason CT:tä 24 tunnin CT- ja 5 päivän MRI-kuviin. Tämän mittauksen saamiseksi vaadittavat vaiheet sisältävät iskeemisen leesion hahmottamisen seurantakuvista käyttäen "maskia" (kuvattu aiemmin) ja rekisteröintiä, menettelyä, joka mahdollistaa tarkan vertailun aivojen eri kuvien välillä, jopa eri aikoina ja yksilöillä. AD voidaan laskea vertaamalla kahta mahdollista rekisteröintitapaa ja erityisesti kvantifioimalla eron lineaarisen ja epälineaarisen rekisteröinnin kautta käsiteltyjen leesionmaskien välillä Harstonin vuonna 2018 kuvaileman menetelmän mukaisesti. Kaikki kuvankäsittely ja analyysi suoritetaan käyttäen FSL-ohjelmistoa (FMRIB Software Library v6.0, Analysis Group, FMRIB, Oxford, UK), ilmaiskäyttöistä ohjelmistoa, jonka Oxfordin yliopiston tutkimusryhmä on kehittänyt. Vähentämällä AD kokonaiseen leesiontilavuudesta tutkijat voivat saada korjatun infarktitilavuuden.

Laboratorioprotokolla:

Biomarkkerimittaukset ovat sokeutettuja kliiniselle aineistolle. Kaikissa potilaissa seuraavien tulehdukseen, veri-aivoesteen häiriöön ja reperfuusiovammaan liittyvien biomarkkerien seerumitasot mitataan saapuessa ja 24 tunnin kuluttua.

Ne voidaan jakaa kolmeen ryhmään mittausmenetelmän tyypin ja nopeuden mukaan:

• nopeasti saatavilla olevat molekyylit: alfa 2 makroglobuliini (A2M); seerumi amyloidi A proteiini (SAA); haptoglobiini (Hp); herkkä C-reaktiivinen proteiini (hsCRP); neuroni-spesifinen enolaasi (NSE); S100Beta (S100B)
• biomarkkerit, jotka vaativat pidempiä aikoja mitattavaksi: pro- ja anti-inflammatoriset sytokiinit ja kemokiinit, matriisimetalloproteaasit (MMP:t) ja niiden estäjät (TIMP:t), von Willebrandin tekijä (vWF), endoteliaalisen dysfunktion markkerit ja tiiviiden liitosten proteiinit.
• Metabolomiset ja lipoproteomiset biomarkkerit

Kaikki tiedot raportoidaan omassa Case report form (CRF) -lomakkeessa.

Lopputulosmittari

Ensisijainen lopputulosmittari:

1. Infarktin kasvu, hemorraginen transformaatio ja aivoödeema

   Toissijainen lopputulosmittari:

2. Toiminnallinen lopputulos Toiminnallinen lopputulos arvioidaan mittaamalla muokattua Rankin-asteikkoa 3 kuukautta akuutin iskeemisen aivohalvauksen alkamisen jälkeen.

Tilastollinen analyysisuunnitelma:

Yksimuuttujaisia lineaarisen regression analyysejä suoritetaan arvioidakseen jokaisen ensisijaisen radiologisen lopputuloksen ja valittujen perustason muuttujien (mukaan lukien kiertävät biomarkkerit) välisiä yhteyksiä. Yksimuuttujaisessa analyysissä lopputulokseen liittyvät riippumattomat muuttujat sisällytetään monimuuttujamalleihin.

Toisessa analyysissä luodaan yksimuuttujaisia logistisen regression malleja arvioidakseen perustason kiertävien ja radiologisten biomarkkerien sekä kliinisten muuttujien ja kolmen kuukauden kuluttua tallennetun dikotomioidun mRS-pisteen välisiä yhteyksiä. Yksimuuttujaisessa analyysissä merkittäviksi havaittujen riskitekijöiden sisällytetään moninkertaiseen logistiseen regressiomalliin taaksepäin valintakriteerillä.

PREKLININEN ASETELMA

Eettinen lausunto prekliinisestä tutkimuksesta:

Kaikki hiiriin liittyvät toimenpiteet suoritetaan Italian terveysministerin luvan nro 723/2019 säädösten mukaisesti.

Hiiret pidetään kirkkaissa muovisissa häkeissä 12 tunnin valo/pimeä-syklissä ja niillä on vapaasti pääsy veteen ja ruokaan. Tutkijat käyttävät transgeenistä hiirilinjaa, C57BL/6J-Tg(Thy1-EGFP)MJrs/J, Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine USA) -yhtiöltä.

Hiirimalli keskiaivovaltimon (MCA) okkluusiosta ja resirkulaatiosta:

Tässä projektissa sovelletaan uutta menetelmää ohimenevään fototromboottiseen distaaliin MCA-okkluusioon, jonka ryhmämme on kehittänyt. Lyhyesti, fototromboottinen MCA-okkluusio suoritetaan säteilemällä distaalia MCA:ta keskitetyllä vihreällä laserilla, kun on annettu intraperitoneaalinen ruiske valoherkästä väriaineesta Rose Bengalista. Valittuina aikoina MCA-okkluusion jälkeen (30 min, 60 min, 90 min), resirkulaatio suoritetaan säteilemällä okkluoidun distaalin MCA:n ultravioletti (UV) LED:llä, joka kykenee hajottamaan verihyytymän sisällä olevat fibriinisidokset.

Dendriittien ja verisuoniston in vivo kaksifotonkuvantamista:

Tutkitaan aksonien ja dendriittien rakenteellista plastisuutta aivohalvauksen akuutissa vaiheessa verrattuna ennen aivohalvausta olleeseen tilaan. Thy1-GFP-hiirissä tehdään kraniaalinen ikkuna infarktialueen läheisyyteen mahdollistaakseen pysyvän optisen pääsyn hiiren aivokuoreen. Kraniaalisen ikkunan pinnallisia verisuonia käytetään maamerkkinä löytääkseen saman aivokuoren alueen uudelleen eri kuvantamiskerroissa suorittaen pitkittäistutkimuksen synaptisten terminaalien vaihtuvuudesta ja neuroniprosessien suunnasta. Lisäksi karakterisoidaan verisuoniston läpäisevyys kapillaaritasolla. Tätä tarkoitusta varten suoritetaan systeminen ruiske fluoresoivasta väriaineesta (esim. Texas Red Dextran, Thermo Fisher Scientific, USA) hiirien häntäsuoneen juuri ennen kuvantamiskertaa. Tämä väriaine on elinvoimainen useita tunteja ruiskutuksen jälkeen ja diffundoituu parenkyymiin vain jos ja missä ekstravasaatiota tapahtuu. Sitten otetaan kuvapinoja merkittyyn verisuonistoon 5 minuutin välein välittömästi 30 minuutin kuluttua ruiskutuksesta. Verisuonten läpäisevyyden arvioimiseksi in vivo suoritetaan keskimääräisten fluoresenssiarvojen mittaaminen neliömäisellä alueella, joka on keskitetty joko verisuonen sisälle tai sen ulkopuolelle, ja toistetaan mitta samassa paikassa eri aikoina ruiskutuksen jälkeen. Läpäisevyys κ(t) lasketaan seuraavan Nhanin vuonna 2013 kuvaileman kaavan mukaan: [κ(t) = (dIe/dt)/[(Ii(t)/0.55)-(Ie(t)/(Ve/Vi)].

Ödeema:

24 tuntia aivohalvauksen aiheuttamisen jälkeen, aivoveden sisältö, epäsuorana mittana aivoödeemasta, lasketaan uhratuissa hiirissä Kenne ja yhteistyökumppanien mukaisesti. Aivot jaetaan pitkittäissuunnassa ja vastakkaiset ja samanpuoleiset kudokset punnitaan välittömästi poistamisen jälkeen saadakseen märkäpainon (WW). Kudokset kuivataan 60°C:ssa 72 tuntia ja punnitaan saadakseen kuivapaino (DW). Veden sisältö lasketaan prosentteina märkäpainosta; % veden sisältö = [(WW-DW)/(WW)]*100.

Kiertävien biomarkkerien tutkimus:

Testatakseen eri aikoina (ennen aivohalvausta, perustasolla ja 24 tuntia okkluusion jälkeen) samoja veribiomarkkereita, joita arvioidaan potilailla, veri otetaan anestesoiduista hiiristä retro-orbitaalisen sinusin kautta.

Tilastolliset analyysit:

Otos jaetaan kolmeen kokeelliseen ryhmään (Sham, Ei-Resirkuloitu ja Resirkuloitu). Otoskokoista varten tutkijat käyttävät ANOVA-testiä (kiinteät vaikutukset, omnibus, yksisuuntainen) ja seuraavia tietoja: 3 kokeellista ryhmää, vaikutuksen koko f = 0.5, α = 0.05, Teho = 0.8 (käytetty ohjelmisto G*Power, versio 3.1.9.2, Franz Faul, Kielin yliopisto, Saksa). Kolmen ryhmän hiirien tietoja verrataan eri aikoina (ennen aivohalvausta, perustasolla ja 24 aivohalvauksen jälkeen). Toistettujen mittausten yksisuuntaista varianssianalyysiä (ANOVA) suoritetaan kaksifotonkuvantamisen datalle arvioidakseen synaptista vaihtuvuutta ja veri-aivoesteen läpäisevyyttä aivokuoren verisuonissa eri aikoina. Tiedot annetaan keskiarvona ± keskiarvon keskivirheenä.

Rahoitus:

• Toscanan alue "Bando Salute 2018";
• #NEXTGENERATIONEU (NGEU) ja rahoitettu opetus- ja tutkimusministeriön (MUR) toimesta, kansallinen elpymis- ja resilienssisuunnitelma (NRRP), projekti MNESYS (PE0000006) - Moniasteinen integroitu lähestymistapa hermoston tutkimukseen terveydessä ja sairaudessa (DN. 1553 11.10.2022).