Влажные и сухие биомаркеры для прогнозирования вторичного повреждения при инсульте: от лаборатории до клинической практики - исследование NIMBLE (NIMBLE)

ФОН Рост инфаркта (РИ), геморрагическая трансформация (ГТ) и церебральный отек (ЦО) являются ключевыми факторами, связанными с негативным исходом у пациентов с ишемическим инсультом, несмотря на успех реканализации. Бесполезная реперфузия и реперфузионное повреждение связаны с этими вредными явлениями, но их механизмы остаются в значительной степени непонятыми и, следовательно, их трудно предсказать и предотвратить. Различные исследования показали, что некоторые циркулирующие биомаркеры связаны с развитием РИ, ГТ и ЦО.

Исследование NIMBLE (Интеграция новых методов нейровизуализации и циркулирующих биомаркеров для прогнозирования вторичного повреждения после инсульта: от лаборатории к постели больного) — это трансляционный проект, включающий клинические исследования на людях и экспериментальные исследования на животных. Его цель — изучить возможные факторы, способствующие РИ, ГТ и ЦО после ишемии, путем изучения циркулирующих биомаркеров в отношении нейровизуализационных аномалий и функционального исхода у людей. У мышей циркулирующие биомаркеры изучаются в отношении нейрональной реорганизации на клеточном и субклеточном уровне, а также экспериментальной оценки ЦО.

КЛИНИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Дизайн исследования:

Одноцентровое, лонгитюдное, проспективное наблюдательное исследование с последующим наблюдением, включающее последовательную серию пациентов с передним острым ишемическим инсультом, поступивших в отделение неотложной помощи в течение 12 часов с момента появления симптомов, получавших или не получавших реваскуляризационную терапию.

Все пациенты проходят нейровизуализационное обследование и забор крови для определения уровня нескольких сывороточных циркулирующих биомаркеров (подробности см. ниже).

Набор пациентов проводился с 24.04.2021 по 30.06.2023, всего 213 пациентов, медиана возраста [IQR (межквартильный размах)] 80 [16] лет, 46% женщин, медиана исходного NIHSS (шкала инсульта Национальных институтов здравоохранения) [IQR] 10 [3].

Методология работы:

Клиническая оценка:

Для каждого пациента регистрируется полный спектр клинических данных, включая факторы риска инсульта, лечение острого инсульта, препараты, принимавшиеся до инсульта. Тяжесть инсульта измеряется с помощью NIHSS на исходном уровне и при последующем наблюдении через 1, 7 и 90 дней, а постинсультная инвалидность — с помощью модифицированной шкалы Рэнкина (mRS), проводимой через 3 месяца при визите или телефонном интервью.

Нейрорадиологическая оценка:

Нейрорадиологическая оценка проводится вслепую к клиническим данным. Визуализация головного мозга включает исходную нативную КТ и, при клинических показаниях, многофазную КТ-ангиографию и КТ-перфузию на исходном уровне. Выполняются КТ через 24 часа и МРТ без контраста через 5 дней (включая последовательности диффузионно-взвешенного изображения (DWI), кажущегося коэффициента диффузии (ADC), подавления сигнала от жидкости (FLAIR) и быстрого полевого эхо (FFE)).

Ранние ишемические признаки (оценка по шкале ASPECTS), наличие и тяжесть микроангиопатии, наличие и степень ЦО и ГТ оцениваются двумя нейрорадиологами по исходным и контрольным КТ-сканам.

ЦО классифицируется согласно критериям SITS-ISTR (Безопасная реализация методов лечения инсульта — Международный регистр тромболизиса при инсульте):

COED1 = локальный отек мозга до одной трети полушария, COED2 = локальный отек мозга более одной трети полушария, COED3 = отек мозга со смещением срединных структур, NONE = отсутствие церебрального отека.

ГТ оценивается согласно рентгенографической классификации ECASS (Европейское кооперативное исследование острого инсульта):

HI-1: Геморрагический инфаркт тип 1 = мелкие петехии HI-2: Геморрагический инфаркт тип 2 = более сливные петехии PH-1: Паренхиматозная гематома тип 1 = <30% зоны инфаркта с незначительным объемным эффектом PH-2: Паренхиматозная гематома тип 2 = >30% зоны инфаркта со значительным объемным эффектом Данные перфузии, полученные в соответствии с местным клиническим протоколом, оцениваются экспертом-нейрорадиологом для определения объема ядра инфаркта и зоны гипоперфузии.

Кроме того, проводится МРТ-характеристика отека для дифференциации вазогенного отека от цитотоксического путем анализа характеристик сигнала и морфологии поражения.

Также применяется новый метод количественной оценки отека мозга (вызванного ЦО и ГТ) и определения роста поражения и окончательного объема инфаркта, называемый анатомической дисторсией (АД).

Два эксперта-оператора независимо создадут ручное картирование («маску») ишемического поражения, видимого на КТ-скане через 24 часа. Один оператор также определит «маску» поражения на МРТ-скане через 5 дней (используя последовательность DWI). Любые расхождения будут разрешены отдельным нейрорадиологом. Для этого процесса будет использоваться FSLeyes, программное обеспечение, входящее в состав FSL (FMRIB Software Library v6.0, созданное Analysis Group, FMRIB, Оксфорд, Великобритания), которое позволяет создавать трехмерную маску поражения для каждого пациента, покрывающую инфарктную ткань на всех КТ-срезах. Предыдущие/неострые ишемические поражения (уже присутствующие на исходной КТ) не будут включены в маски.

АД будет оцениваться путем сравнения исходной КТ с КТ через 24 часа и МРТ через 5 дней. Шаги, необходимые для получения этого измерения, включают очерчивание ишемического поражения, видимого на контрольных сканах, с помощью «маски» (описанной ранее), и регистрацию — процедуру, позволяющую точно сравнивать различные изображения мозга, даже в разное время и у разных людей. АД может быть рассчитана путем сравнения двух возможных подходов к регистрации и, в частности, путем количественной оценки разницы между масками поражения, обработанными с помощью линейной и нелинейной регистрации, согласно методу, описанному Харстоном в 2018 году. Вся обработка и анализ изображений будут проводиться с использованием программного обеспечения FSL (FMRIB Software Library v6.0, созданного Analysis Group, FMRIB, Оксфорд, Великобритания), бесплатного программного обеспечения, разработанного исследовательской группой Оксфордского университета. Вычитая АД из общего объема поражения, исследователи могут получить скорректированный объем инфаркта.

Лабораторный протокол:

Измерения биомаркеров проводятся вслепую к клиническим данным. У всех пациентов при поступлении и через 24 часа измеряются следующие сывороточные уровни биомаркеров, связанных с воспалением, нарушением гематоэнцефалического барьера и реперфузионным повреждением.

Их можно разделить на три группы в зависимости от типа и скорости методики измерения:

• быстро доступные молекулы: альфа-2-макроглобулин (A2M); сывороточный амилоидный белок A (SAA); гаптоглобин (Hp); высокочувствительный C-реактивный белок (hsCRP); нейрон-специфическая енолаза (NSE); S100Beta (S100B)
• биомаркеры, требующие более длительного времени для измерения: провоспалительные и противовоспалительные цитокины и хемокины, матриксные металлопротеиназы (MMP) и их ингибиторы (TIMP), фактор Виллебранда (vWF), маркеры эндотелиальной дисфункции и белки плотных контактов.
• Метаболомные и липопротеомные биомаркеры

Все данные заносятся в специальную Карту регистрации случая (CRF).

Критерии оценки исхода

Основной критерий оценки исхода:

1. Рост инфаркта, геморрагическая трансформация и церебральный отек

   Вторичный критерий оценки исхода:

2. Функциональный исход Функциональный исход будет оцениваться путем измерения модифицированной шкалы Рэнкина через 3 месяца после начала острого ишемического инсульта.

План статистического анализа:

Будут проведены одномерные линейные регрессионные анализы для оценки связи между каждым основным радиологическим исходом и выбранными исходными переменными (включая циркулирующие биомаркеры). Независимые переменные, связанные с исходом при одномерном анализе, будут включены в многомерные модели.

В другом анализе будут созданы одномерные логистические регрессионные модели для оценки связи между исходными циркулирующими и радиологическими биомаркерами и клиническими переменными и дихотомизированной оценкой mRS, зарегистрированной через три месяца. Факторы риска, оказавшиеся значимыми при одномерном анализе, войдут в множественную логистическую регрессионную модель с критерием обратного отбора.

ДОКЛИНИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Этическое заявление доклинического исследования:

Все процедуры с участием мышей выполняются в соответствии с правилами Министерства здравоохранения Италии, разрешение № 723/2019.

Мыши содержатся в прозрачных пластиковых клетках при 12-часовом световом/темновом цикле и имеют свободный доступ к воде и пище. Исследователи используют трансгенную линию мышей C57BL/6J-Tg(Thy1-EGFP)MJrs/J от Jackson Laboratories (Бар-Харбор, Мэн, США).

Модель окклюзии и реканализации средней мозговой артерии (СМА) у мышей:

В этом проекте применяется новый метод транзиторной фототромботической дистальной окклюзии СМА, разработанный нашей группой. Кратко: фототромботическая окклюзия СМА выполняется путем облучения дистальной СМА сфокусированным зеленым лазером после внутрибрюшинной инъекции фотосенсибилизирующего красителя Роз Бенгаль. В выбранные моменты времени после окклюзии СМА (30 мин, 60 мин, 90 мин) реканализация выполняется путем облучения окклюзированной дистальной СМА ультрафиолетовым (УФ) светодиодом, способным разрушать фибриновые связи внутри сгустка.

Двухфотонная визуализация дендритов и сосудистой сети in vivo:

Исследуется структурная пластичность аксонов и дендритов в острой фазе после инсульта по сравнению с состоянием до инсульта. У мышей Thy1-GFP выполняется краниальное окно в периинфарктной области для обеспечения постоянного оптического доступа к коре головного мозга мыши. Поверхностные кровеносные сосуды краниального окна используются как ориентир для повторного нахождения того же участка коры в разных сеансах визуализации, проводя лонгитюдное исследование оборота синаптических терминалей и ориентации нейрональных отростков. Кроме того, характеризуется сосудистая проницаемость на уровне капилляров. Для этой цели выполняется системная инъекция флуоресцентного красителя (например, Texas Red Dextran, Thermo Fisher Scientific, США) в хвостовую вену мышей непосредственно перед сеансом визуализации. Этот краситель жизнеспособен в течение нескольких часов после инъекции и диффундирует в паренхиму только если и там, где происходит экстравазация. Затем приобретаются стеки изображений меченой сосудистой сети каждые 5 минут от момента сразу после инъекции до 30 минут после нее. Для оценки проницаемости кровеносных сосудов in vivo выполняется измерение средних значений флуоресценции в квадратной области интереса, центрированной либо внутри, либо непосредственно снаружи кровеносного сосуда, и повторение измерения в том же месте в разные моменты времени после инъекции. Проницаемость κ(t) будет рассчитываться по следующей формуле, описанной Нханом в 2013 году: [κ(t) = (dIe/dt)/[(Ii(t)/0.55)-(Ie(t)/(Ve/Vi)].

Отек:

Через 24 часа после индукции инсульта у умерщвленных мышей рассчитывается содержание воды в мозге как косвенная мера церебрального отека, согласно Кенне и соавторам. Мозг разделяется по средней линии, и контралатеральная и ипсилатеральная ткани взвешиваются сразу после удаления для получения влажного веса (ВВ). Ткани высушиваются при 60°C в течение 72 часов и взвешиваются для получения сухого веса (СВ). Содержание воды рассчитывается в процентах от влажного веса; % содержания воды = [(ВВ-СВ)/(ВВ)]*100.

Исследование циркулирующих биомаркеров:

Для тестирования в разные моменты времени (до инсульта, исходно и через 24 часа после окклюзии) тех же биомаркеров крови, что оцениваются у пациентов, кровь забирается через ретробульбарный синус у анестезированных мышей.

Статистические анализы:

Выборка будет разделена на три экспериментальные группы (Sham, No-Recanalized и Recanalized). Для расчета размера выборки исследователи будут использовать тест ANOVA (фиксированные эффекты, омнибус, односторонний) и следующие данные: 3 экспериментальные группы, размер эффекта f = 0.5, α = 0.05, Мощность = 0.8 (используемое ПО G * Power, версия 3.1.9.2, Франц Фаул, Университет Киля, Германия). Данные мышей трех групп будут сравниваться в разные моменты времени (до инсульта, исходно и через 24 часа после инсульта). Для оценки оборота синапсов и проницаемости гематоэнцефалического барьера корковых кровеносных сосудов в разные моменты времени будет проведен односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с повторными измерениями по данным двухфотонной визуализации. Данные будут представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего.

Финансирование:

• Регион Тоскана "Bando Salute 2018";
• #NEXTGENERATIONEU (NGEU) и финансируется Министерством университетов и исследований (MUR), Национальным планом восстановления и устойчивости (NRRP), проект MNESYS (PE0000006) — Мультимасштабный интегрированный подход к изучению нервной системы в здоровье и болезни (DN. 1553 11.10.2022).