Våde og tørre biomarkører til at forudsige sekundær skade ved slagtilfælde: Fra laboratoriebord til hospitalsgang - NIMBLE-studiet (NIMBLE)

BAGGRUND Infarkt vækst (IG), hæmoragisk transformation (HT) og cerebral ødem (CE) er nøglefaktorer forbundet med en negativ udgang hos patienter med iskæmisk slagtilfælde, på trods af succes med rekanalisering. Futile reperfusion og reperfusionsskade er forbundet med disse skadelige fænomener, men deres mekanismer forbliver i vid udstrækning uforståede og følgelig er de svære at forudsige og forhindre. Forskellige undersøgelser har vist, at nogle cirkulerende biomarkører er forbundet med udviklingen af IG, HT og CE.

NIMBLE-studiet (Integrating novel NeuroImaging Measurements and circulating Biomarkers for the prediction of secondary injury foLlowing strokE: from bench to bedside) er et translationsprojekt, der inkluderer klinisk forskning på mennesker og eksperimentel undersøgelse på dyr. Det har til formål at undersøge mulige faktorer, der bidrager til IG, HT og CE efter iskæmi ved at studere cirkulerende biomarkører i forhold til neuroimaging-abnormaliteter og funktionelt udfald hos mennesker. Hos mus studeres cirkulerende biomarkører i forhold til den neuronale omorganisering på cellulært og subcellulært niveau og til eksperimentel evaluering af CE.

KLINISK RAMME

Studiedesign:

Enkeltcenter, longitudinelt, opfølgende prospektivt observationsstudie, der inkluderer en konsekutiv serie af patienter med akut anterior iskæmisk slagtilfælde, der præsenteres inden for 12 timer fra symptomstart på skadestuen, enten behandlet eller ikke behandlet med revaskulariseringsterapier.

Alle patienter gennemgår neuroimaging-evaluering og blodprøvetagning til dosisbestemmelse af flere serumcirkulerende biomarkører (se nedenfor for detaljer).

Patientinklusion fandt sted mellem 24/04/2021 og 30/06/2023 for i alt 213 patienter, medianalder [IQR (interkvartilområde)] 80 [16] år, 46% kvinder, median baseline NIHSS (National Institutes of Health Stroke Scale) [IQR] 10 [3]

Arbejdsmetodologi:

Klinisk vurdering:

Et fuldt udvalg af kliniske data, herunder slagtilfældsrisikofaktorer, akut slagtilfældsbehandling, præ-slagtilfældsmedicin registreres for hver patient. Slagtilfældssværhed måles ved hjælp af NIHSS ved baseline og ved 1, 7 og 90 dages opfølgning, og post-slagtilfælds-handicap ved den modificerede Rankin-skala (mRS) administreret efter 3 måneder ved besøg eller telefoninterview.

Neuroradiologisk evaluering:

Neuroradiologisk evaluering er blindet for kliniske data. Hjerneimaging inkluderer baseline almindelig CT, og, når klinisk indikeret, CT (computertomografi) multifaseangiografi og CT-perfusion ved baseline. CT efter 24 timer og ikke-kontrast MRI efter 5 dage (inklusive diffusion-vægtet billeddannelse (DWI), tilsyneladende diffusionskoefficient (ADC), fluid-attenuated inversion recovery (FLAIR) og fast field echo (FFE) sekvenser) udføres.

Tidlige iskæmiske tegn (Alberta Stroke Programme Early CT [ASPECTS]-score), tilstedeværelse og sværhedsgrad af småkarssygdom, tilstedeværelse og graduering af CE og HT vurderes af to neuroradiologer ved baseline og opfølgende CT-scanninger.

CE klassificeres efter SITS-ISTR (Safe Implementation of Treatments in Stroke - International Stroke Thrombolysis Register) kriterier:

COED1 = fokal hjernesvulst op til en tredjedel af hemisfæren, COED2 = fokal hjernesvulst større end en tredjedel af hemisfæren, COED3 = hjernesvulst med midtlinjeforskydning, NONE = fravær af cerebral ødem.

HT vurderes efter ECASS (European Cooperative Acute Stroke Study) radiografisk klassifikation:

HI-1: Hæmoragisk infarkt type 1 = små petekkier HI-2: Hæmoragisk infarkt type 2 = mere sammenflydende petekkier PH-1: Parenkymal hæmatom type 1 = <30% af infarkteret område med mild rumoptagende effekt PH-2: Parenkymal hæmatom type 2 = >30% af infarkteret område med signifikant rumoptagende effekt Perfusionsdata afledt efter lokal klinisk protokol evalueres af en ekspertneuroradiolog for at detektere infarktkerne og hypoperfusionsvolumener.

Desuden udføres en MRI-karakterisering af ødemet for at differentiere vasogent ødem fra cytotoksisk ødem ved at analysere signalegenskaberne og den lesionale morfologi.

En ny metode til at kvantificere hjernesvulst (induceret af CE og HT) og til at definere læsionsvækst og endeligt infarktvolumen, kaldet anatomisk distortion (AD), anvendes også.

To ekspertoperatører vil uafhængigt skabe en manuel kortlægning ("maske") af den iskæmiske læsion synlig på 24-timers CT-scanningen. En læsions-"maske" vil blive defineret af en operatør også på 5-dages MRI (Magnetic Resonance Imaging) scanning (ved brug af DWI-sekvens). Eventuelle uoverensstemmelser vil blive løst af en separat neuroradiolog. Til denne proces vil FSLeyes blive brugt, en software inkluderet i FSL-softwaren (FMRIB [Functional Magnetic Resonance Imaging of the Brain] Software Library v6.0, Created by the Analysis Group, FMRIB, Oxford, UK), som tilbyder muligheden for at generere en tredimensionel læsionsmaske for hver patient, der dækker infarktvævet på alle CT-sektioner. Tidligere/ikke-akutte iskæmiske læsioner (allerede til stede på baseline CT) vil ikke blive inkluderet i maskerne.

AD vil blive vurderet ved at sammenligne baseline CT med 24-timers CT og 5-dages MRI scanninger. Trinene, der kræves for at opnå denne måling, inkluderer at afgrænse den iskæmiske læsion synlig på opfølgende scanninger ved brug af en "maske" (beskrevet før) og registrering, en procedure, der muliggør nøjagtig sammenligning mellem forskellige billeder af hjernen, selv på forskellige tidspunkter og individer. AD kan beregnes ved at sammenligne de to mulige registreringsmetoder og især ved at kvantificere forskellen mellem læsionsmaskerne behandlet gennem lineær og ikke-lineær registrering i henhold til metoden beskrevet af Harston i 2018. Al billedbehandling og -analyse vil blive udført ved brug af FSL-software (FMRIB Software Library v6.0, Created by the Analysis Group, FMRIB, Oxford, UK), en fri adgangssoftware udviklet af en forskergruppe fra University of Oxford. Ved at trække AD fra det samlede læsionsvolumen kan forskerne opnå det korrigerede infarktvolumen.

Laboratorieprotokol:

Biomarkørmålinger er blindet for kliniske data. Hos alle patienter måles følgende serumkoncentrationer af biomarkører forbundet med inflammation, blod-hjerne-barriere-forstyrrelse og reperfusionsskade ved ankomst og efter 24 timer.

De kan opdeles i tre grupper efter typen og hastigheden af måleteknikken:

• hurtigt tilgængelige molekyler: alfa 2 makroglobulin (A2M); Serum Amyloid A protein (SAA); Haptoglobin (Hp); højfølsomt C-reaktivt protein (hsCRP); Neuron-specifikt enolase (NSE); S100Beta (S100B)
• biomarkører, der kræver længere tid at måle: pro- og anti-inflammatoriske cytokiner og kemokiner, matrix metalloproteaser (MMPs) og deres inhibitorer (TIMPs), von Willebrand-faktor (vWF), endothelial dysfunktionsmarkører og tight junction-proteiner.
• Metabolomiske og lipoproteomiske biomarkører

Alle data rapporteres i en dedikeret Case report form (CRF).

Udgangsmål

Primært udgangsmål:

1. Infarkt vækst, hæmoragisk transformation og cerebral ødem

   Sekundært udgangsmål:

2. Funktionelt udfald Funktionelt udfald vil blive vurderet ved at måle den modificerede Rankin-skala 3 måneder efter akut iskæmisk slagtilfældes start.

Statistisk analyseplan:

Univariate lineære regressionsanalyser vil blive udført for at evaluere sammenhængen mellem hvert primært radiologisk udfald og udvalgte baselinevariable (inklusive cirkulerende biomarkører). Uafhængige variable forbundet med udfaldet ved univariat analyse vil blive inkluderet i multivariate modeller.

I en anden analyse vil univariate logistiske regressionsmodeller blive oprettet for at vurdere sammenhængen mellem baseline cirkulerende og radiologiske biomarkører og kliniske variable og den dikotomiserede mRS-score registreret efter tre måneder. Risikofaktorerne, der viser sig at være signifikante i en univariat analyse, vil indgå i en multipel logistisk regressionsmodel med et bagudvalgskriterium.

PRÆKLINISK RAMME

Etisk erklæring præklinisk forskning:

Alle procedurer, der involverer mus, udføres i overensstemmelse med bestemmelser fra det italienske sundhedsministeriums autorisation nr. 723/2019.

Mus huses i gennemsigtige plastikbur under en 12 timers lys/mørkecyklus og har fri adgang til vand og mad. Forskerne bruger en transgen muslinje, C57BL/6J-Tg(Thy1-EGFP)MJrs/J, fra Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine USA).

Musemodel for Middle Cerebral Artery (MCA) okklusion og rekanalisering:

I dette projekt anvendes en ny metode til transient fototrombotisk distal MCA-okklusion udviklet af vores gruppe. Kort fortalt udføres fototrombotisk MCA-okklusion ved at bestråle den distale MCA med en fokuseret grøn laser efter en intraperitoneal injektion af den fotosensitive farvestof Rose Bengal. På udvalgte tidspunkter efter MCA-okklusion (30 min, 60 min, 90 min) udføres rekanalisering ved at bestråle den okkluderede distale MCA med en ultraviolet (UV) LED i stand til at bryde fibrinfibrene inde i koaglet.

In vivo two-photon imaging af dendritter og vaskulatur:

Den strukturelle plasticitet af axoner og dendritter i den akutte fase efter slagtilfælde sammenlignet med præ-slagtilfælde-tilstand undersøges. I Thy1-GFP-mus udføres et kranievindue på det peri-infarkt område for at tillade permanent optisk adgang til musekortexen. De overfladiske blodkar i kranievinduet bruges som et landemærke til at genskende den samme region af kortexen i forskellige imaging-sessioner, der udfører en longitudinel undersøgelse af synaptisk terminalomsætning og neuronale processers orientering. Desuden karakteriseres den vaskulære permeabilitet på kapillærniveau. Til dette formål udføres en systemisk injektion af et fluorescerende farvestof (f.eks. Texas Red Dextran, Thermo Fisher Scientific, USA) i halen af mus lige før imaging-sessionen. Dette farvestof er vitalt i flere timer efter injektionen og diffunderer ind i parenkymet kun hvis og hvor ekstravasation forekommer. Derefter optages imaging-stakke af det mærkede vaskulatur hvert 5. minut fra umiddelbart til 30 minutter efter injektion. For at evaluere permeabiliteten af blodkar in vivo udføres de gennemsnitlige fluorescensværdier inden for et kvadratisk Region of Interest centreret enten inde i eller lige uden for et blodkar og gentager målingen på samme sted på forskellige tidspunkter efter injektion. Permeabiliteten κ(t) vil blive beregnet efter følgende formel beskrevet af Nhan i 2013: [κ(t) = (dIe/dt)/[(Ii(t)/0.55)-(Ie(t)/(Ve/Vi)].

Ødem:

24 timer efter slagtilfældeinduktion beregnes hjernens vandindhold, som et indirekte mål for cerebral ødem, i ofrede mus i henhold til Kenne og samarbejdspartnere. Hjernen deles langs midtlinjen, og de kontralaterale og ipsilaterale væv vejes umiddelbart efter fjernelse for at opnå våd vægt (WW). Vævet tørres ved 60°C i 72 timer og vejes for at opnå tør vægt (DW). Vandindhold beregnes som en procentdel af våd vægt; % vandindhold = [(WW-DW)/(WW)]*100.

Undersøgelse af cirkulerende biomarkører:

For at teste på forskellige tidspunkter (præ-slagtilfælde, baseline og 24 timer efter okklusionen) de samme blodbiomarkører evalueret hos patienter, tages blod gennem den retro-orbitale sinus i anæstetiserede mus.

Statistiske analyser:

Prøven vil blive opdelt i tre eksperimentelle grupper (Sham, No-Recanalized og Recanalized). Til prøvestørrelsesbestemmelse vil forskerne bruge ANOVA-testen (fixed effects, omnibus, one-way) og følgende data: 3 eksperimentelle grupper, effektstørrelse f = 0.5, α = 0.05, Power = 0.8 (software brugt G * Power, version 3.1.9.2, Franz Faul, University of Kiel, Germany). Data fra mus i de tre grupper vil blive sammenlignet på forskellige tidspunkter (præ-slagtilfælde, baseline og 24 efter slagtilfælde). En one-way analysis of variance (ANOVA) repeated measures vil blive udført på two-photon imaging-data for at vurdere den synaptiske omsætning og blod-hjerne-barriere-permeabilitet af kortikale blodkar på forskellige tidspunkter. Data vil blive givet som middelværdi ± standardfejl af middelværdien.

Finansiering:

• Toscana Region "Bando Salute 2018";
• #NEXTGENERATIONEU (NGEU) og finansieret af Ministeriet for Universiteter og Forskning (MUR), National Recovery and Resilience Plan (NRRP), projekt MNESYS (PE0000006) - A Multiscale integrated approach to the study of the nervous system in health and disease (DN. 1553 11.10.2022).