Våta och torra biomarkörer för att förutsäga sekundär skada vid stroke: Från labb till sjukbädd - NIMBLE-studien (NIMBLE)

BAKGRUND Infarkttillväxt (IG), hemorragisk transformation (HT) och cerebralt ödem (CE) är nyckelfaktorer associerade med ett negativt utfall hos patienter med ischemisk stroke, trots framgångsrik rekanalisering. Futil reperfusion och reperfusionsskada är kopplade till dessa skadliga fenomen, men deras mekanismer förblir i stort sett oförstådda och därmed svåra att förutsäga och förhindra. Flera studier har visat att vissa cirkulerande biomarkörer är associerade med utvecklingen av IG, HT och CE.

NIMBLE-studien (Integrating novel NeuroImaging Measurements and circulating Biomarkers for the prediction of secondary injury foLlowing strokE: from bench to bedside) är ett translationsprojekt som inkluderar klinisk forskning på människor och experimentell studie på djur. Den har som syfte att undersöka möjliga faktorer som bidrar till IG, HT och CE efter ischemi genom att studera cirkulerande biomarkörer i förhållande till neurobildningsavvikelser och funktionellt utfall hos människor. Hos möss studeras cirkulerande biomarkörer i förhållande till den neuronala omorganisationen på cellulär och subcellulär nivå samt till experimentell utvärdering av CE.

KLINISK MILJÖ

Studiedesign:

Encentrisk, longitudinell, uppföljande prospektiv observationsstudie som inkluderar en konsekutiv serie patienter med akut ischemisk stroke i anterior cirkulation som presenterar sig inom 12 timmar från symtomdebut på akutmottagningen, oavsett om de behandlas med revaskulariserande terapier eller inte.

Alla patienter genomgår neurobildningsutvärdering och blodprovstagning för dosering av flera serumcirkulerande biomarkörer (se nedan för detaljer).

Patientrekrytering skedde mellan 24/04/2021 och 30/06/2023 för totalt 213 patienter, medianålder [IQR (interkvartilavstånd)] 80 [16] år, 46% kvinnor, median NIHSS (National Institutes of Health Stroke Scale) vid baslinje [IQR] 10 [3].

Arbetsmetodik:

Klinisk bedömning:

Ett fullständigt spektrum av kliniska data, inklusive riskfaktorer för stroke, akut strokebehandling och medicinering före stroke, registreras för varje patient. Strokegrad mäts med NIHSS vid baslinje och vid 1, 7 och 90 dagars uppföljning, och post-stroke funktionsnedsättning med den modifierade Rankin-skalan (mRS) som administreras vid 3 månader via besök eller telefonintervju.

Neuroradiologisk utvärdering:

Neuroradiologisk utvärdering är blindad för kliniska data. Hjärnavbildning inkluderar baslinje vanlig DT, och när det är kliniskt indikerat, DT-flerfasangiografi och DT-perfusion vid baslinje. DT vid 24 timmar och icke-kontrastförstärkt MR vid 5 dagar (inklusive diffusionsviktad avbildning (DWI), apparent diffusion coefficient (ADC), fluid-attenuated inversion recovery (FLAIR) och fast field echo (FFE) sekvenser) utförs. Tidiga ischemiska tecken (Alberta Stroke Programme Early CT [ASPECTS]-poäng), förekomst och svårighetsgrad av småkärlssjukdom, förekomst och gradering av CE och HT bedöms av två neuroradiologer vid baslinje och uppföljnings DT-skannningar.

CE klassificeras enligt SITS-ISTR-kriterierna (Safe Implementation of Treatments in Stroke - International Stroke Thrombolysis Register): COED1 = fokal hjärnsvullnad upp till en tredjedel av hemisfären, COED2 = fokal hjärnsvullnad större än en tredjedel av hemisfären, COED3 = hjärnsvullnad med mittlinjeförskjutning, NONE = frånvaro av cerebralt ödem.

HT bedöms enligt ECASS (European Cooperative Acute Stroke Study) radiografisk klassificering: HI-1: Hemorragisk infarkt typ 1 = små petekier HI-2: Hemorragisk infarkt typ 2 = mer konfluerande petekier PH-1: Parenkymatöst hematom typ 1 = <30% av infarktområdet med liten rymdokkuperande effekt PH-2: Parenkymatöst hematom typ 2 = >30% av infarktområdet med signifikant rymdokkuperande effekt. Perfusionsdata som härletts enligt lokal klinisk protokoll utvärderas av en expertneuroradiolog för att detektera infarktkärna och hypoperfusionsvolymer.

Dessutom utförs en MR-karakterisering av ödemet för att differentiera vasogent ödem från cytotoxiskt ödem, genom att analysera signalegenskaperna och lesional morfologi. En ny metod för att kvantifiera hjärnsvullnad (orsakad av CE och HT) och för att definiera lesionstillväxt och slutlig infarktvolym, kallad Anatomical Distortion (AD), tillämpas också.

Två experoperatörer kommer oberoende att skapa en manuell kartläggning ("mask") av den ischemiska lesionen som syns på 24-timmars DT-skanningen. En lesions "mask" kommer att definieras av en operatör även på 5-dagars MR-skanningen (med DWI-sekvens). Eventuella avvikelser kommer att lösas av en separat neuroradiolog. För denna process kommer FSLeyes att användas, en mjukvara inkluderad i FSL-mjukvaran (FMRIB Software Library v6.0, skapad av Analysis Group, FMRIB, Oxford, UK) som erbjuder möjligheten att generera en tredimensionell lesionsmask för varje patient, som täcker infarktvävnaden på alla DT-sektioner. Tidigare/icke-akuta ischemiska lesioner (redan närvarande på baslinje DT) kommer inte att inkluderas i maskerna.

AD kommer att bedömas genom att jämföra baslinje DT med 24-timmars DT och 5-dagars MR-skanningar. Stegen som krävs för att erhålla denna mätning inkluderar att avgränsa den ischemiska lesionen som syns på uppföljningsskanningar med en "mask" (beskrivet tidigare) och registrering, en procedur som möjliggör korrekt jämförelse mellan olika bilder av hjärnan, även vid olika tidpunkter och individer. AD kan beräknas genom att jämföra de två möjliga registreringsmetoderna och särskilt genom att kvantifiera skillnaden mellan lesionsmaskerna bearbetade genom linjär och icke-linjär registrering enligt metoden som beskrivs av Harston 2018. All bildbehandling och analys kommer att utföras med FSL-mjukvara (FMRIB Software Library v6.0, skapad av Analysis Group, FMRIB, Oxford, UK), en fri tillgångsmjukvara utvecklad av en forskargrupp vid University of Oxford. Genom att subtrahera AD från total lesionsvolym kan forskarna erhålla den korrigerade infarktvolymen.

Laboratorieprotokoll:

Biomarkörsmätningar är blindade för kliniska data. Hos alla patienter mäts följande serumnivåer av biomarkörer kopplade till inflammation, blod-hjärnbarriärstörning och reperfusionsskada vid ankomst och efter 24 timmar. De kan delas in i tre grupper enligt typ och hastighet av mättekniken:

• snabbt tillgängliga molekyler: alfa 2-makroglobulin (A2M); Serum Amyloid A protein (SAA); Haptoglobin (Hp); högkänsligt C-reaktivt protein (hsCRP); Neuron-specific enolase (NSE); S100Beta (S100B)
• biomarkörer som kräver längre tid att mäta: pro- och antiinflammatoriska cytokiner och kemokiner, matrix metalloproteaser (MMPs) och deras hämmare (TIMPs), von Willebrand-faktor (vWF), endoteldysfunktionsmarkörer och tight junction-proteiner.
• Metabolomiska och lipoproteomiska biomarkörer

Alla data rapporteras i ett dedikerat Case report form (CRF).

Utfallsmått

Primärt utfallsmått:

1. Infarkttillväxt, Hemorragisk Transformation och Cerebralt Ödem

   Sekundärt utfallsmått:

2. Funktionellt utfall Funktionellt utfall kommer att bedömas genom att mäta den modifierade Rankin-skalan 3 månader efter akut ischemisk stroke.

Statistisk analysplan:

Univariata linjära regressionsanalyser kommer att genomföras för att utvärdera associationen mellan varje primärt radiologiskt utfall och valda baslinjevariabler (inklusive cirkulerande biomarkörer). Oberoende variabler associerade med utfall i univariat analys kommer att inkluderas i multivariata modeller.

I en annan analys kommer univariata logistiska regressionsmodeller att skapas för att bedöma associationen mellan baslinje cirkulerande och radiologiska biomarkörer och kliniska variabler och den dikotomiserade mRS-poängen registrerad vid tre månader. De riskfaktorer som visar sig signifikanta i en univariat analys kommer att ingå i en multipel logistisk regressionsmodell med ett bakåtvalskriterium.

PRECLINISK MILJÖ

Etisk utlåtande preklinisk forskning:

Alla procedurer som involverar möss utförs i enlighet med förordningar från det italienska hälsoministeriet, auktorisation nr 723/2019.

Möss hålls i genomskinliga plastburar under en 12-timmars ljus/mörkercykel och ges fri tillgång till vatten och mat. Forskarna använder en transgen muslinje, C57BL/6J-Tg(Thy1-EGFP)MJrs/J, från Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine USA).

Musmodell för MCA-ocklusion och rekanalisering:

I detta projekt tillämpas en ny metod för transient fototrombotisk distal MCA-ocklusion utvecklad av vår grupp. Kortfattat utförs fototrombotisk MCA-ocklusion genom att bestråla den distala MCA med en fokuserad grön laser, efter en intraperitoneal injektion av den fotokänsliga färgen Rose Bengal. Vid utvalda tidpunkter efter MCA-ocklusion (30 min, 60 min, 90 min) utförs rekanalisering genom att bestråla den ockluderade distala MCA med en ultraviolett (UV) LED som kan bryta fibrinförbindelserna inuti koaglet.

In vivo tvåfotonavbildning av dendriter och vaskulatur:

Den strukturella plasticiteten hos axoner och dendriter i den akuta fasen efter stroke jämfört med för-stroke-tillståndet undersöks. I Thy1-GFP-möss utförs ett kraniefönster på peri-infarktområdet för att möjliggöra permanent optisk åtkomst till mörs bark. De ytliga blodkärlen i kraniefönstret används som en landmärke för att återfinna samma region av barken i olika avbildningssessioner, vilket utför en longitudinell undersökning av synaptiska terminalers omsättning och neuronprocessers orientering. Dessutom karakteriseras den vaskulära permeabiliteten på kapillärnivå. För detta ändamål utförs en systemisk injektion av en fluorescerande färgämne (t.ex. Texas Red Dextran, Thermo Fisher Scientific, USA) i mörs caudala ven precis före avbildningssessionen. Detta färgämne är vitalt i flera timmar efter injektionen och diffunderar in i parenchymet endast om och var extravasation sker. Sedan förvärvas avbildningsstackar av den märkta vaskulaturen var 5:e minut från omedelbart till 30 minuter efter injektion. För att utvärdera blodkärls permeabilitet in vivo utförs de genomsnittliga fluorescensvärdena inom en kvadratisk Region of Interest centrerad antingen inuti eller precis utanför ett blodkärl och upprepar mätningen på samma plats vid olika tidpunkter efter injektion. Permeabiliteten κ(t) kommer att beräknas enligt följande formel beskriven av Nhan 2013: [κ(t) = (dIe/dt)/[(Ii(t)/0.55)-(Ie(t)/(Ve/Vi)].

Ödem:

24 timmar efter strokeinduktion beräknas hjärnans vatteninnehåll, som en indirekt mätning av cerebralt ödem, i avlivade möss, enligt Kenne och medarbetare. Hjärnan delas längs mittlinjen och den kontralaterala och ipsilaterala vävnaden vägs direkt efter borttagning för att erhålla våt vikt (WW). Vävnaden torkas vid 60°C i 72 timmar och vägs för att erhålla torr vikt (DW). Vatteninnehåll beräknas som en procentandel av våt vikt; % vatteninnehåll = [(WW-DW)/(WW)]*100.

Undersökning av cirkulerande biomarkörer:

För att testa vid olika tidpunkter (före stroke, baslinje och 24 timmar efter ocklusionen) samma blodbiomarkörer som utvärderats hos patienter, dras blod genom retro-orbital sinus hos anestetiserade möss.

Statistiska analyser:

Urvalet kommer att delas in i tre experimentella grupper (Sham, Icke-Rekanaliserad och Rekanaliserad). För urvalsstorlek kommer forskarna att använda ANOVA-testet (fasta effekter, omnibus, envägs) och följande data: 3 experimentella grupper, effektstorlek f = 0.5, α = 0.05, Power = 0.8 (mjukvara använd G * Power, version 3.1.9.2, Franz Faul, University of Kiel, Tyskland). Data från möss i de tre grupperna kommer att jämföras vid olika tidpunkter (före stroke, baslinje och 24 efter stroke). En envägs variansanalys (ANOVA) med upprepade mätningar kommer att utföras på tvåfotonavbildningsdata för att bedöma den synaptiska omsättningen och blod-hjärnbarriärens permeabilitet hos kortikala blodkärl vid olika tidpunkter. Data kommer att presenteras som medelvärde ± standardfel för medelvärdet.

Finansiering:

• Toscana Region "Bando Salute 2018";
• #NEXTGENERATIONEU (NGEU) och finansierad av Ministeriet för Universitet och Forskning (MUR), Nationella Återhämtnings- och Resiliensplanen (NRRP), projekt MNESYS (PE0000006) - En multiskala integrerad ansats till studiet av nervsystemet i hälsa och sjukdom (DN. 1553 11.10.2022).