Biomarcatori umidi e secchi per predire il danno secondario nell'ictus: dal laboratorio al letto del paziente - Lo Studio NIMBLE (NIMBLE)

BACKGROUND L’espansione dell’infarto (IG), la trasformazione emorragica (HT) e l’edema cerebrale (CE) sono fattori chiave associati a un esito negativo nei pazienti con ictus ischemico, nonostante il successo della ricanalizzazione. La riperfusione futile e il danno da riperfusione sono collegati a questi fenomeni dannosi, ma i loro meccanismi rimangono in gran parte non compresi e, di conseguenza, sono difficili da prevedere e ostacolare. Vari studi hanno dimostrato che alcuni biomarcatori circolanti sono associati allo sviluppo di IG, HT e CE.

Lo Studio NIMBLE (Integrating novel NeuroImaging Measurements and circulating Biomarkers for the prediction of secondary injury foLlowing strokE: from bench to bedside) è un progetto traslazionale che include la ricerca clinica sull’uomo e lo studio sperimentale sugli animali. Ha l’obiettivo di indagare i possibili fattori che contribuiscono a IG, HT e CE dopo l’ischemia studiando i biomarcatori circolanti in relazione alle anomalie di neuroimaging e all’esito funzionale nell’uomo. Nei topi, i biomarcatori circolanti sono studiati in relazione alla riorganizzazione neuronale a livello cellulare e subcellulare e alla valutazione sperimentale del CE.

AMBITO CLINICO

Disegno dello studio:

Studio osservazionale prospettico longitudinale di follow-up, monocentrico, che arruola una serie consecutiva di pazienti con ictus ischemico acuto anteriore presentatosi entro 12 ore dall’esordio dei sintomi al Pronto Soccorso, trattati o non trattati con terapie di rivascolarizzazione.

Tutti i pazienti si sottopongono a valutazione neuroimaging e prelievo di sangue per il dosaggio di diversi biomarcatori circolanti sierici (vedi dettagli sotto).

L’arruolamento dei pazienti è avvenuto tra il 24/04/2021 e il 30/06/2023 per un totale di 213 pazienti, età mediana [IQR (Intervallo Interquartile)] 80 [16] anni, 46% femmine, NIHSS (National Institutes of Health Stroke Scale) basale mediana [IQR] 10 [3]

Metodologia di lavoro:

Valutazione clinica:

Per ogni paziente vengono registrati un’ampia gamma di dati clinici, inclusi i fattori di rischio per l’ictus, il trattamento acuto dell’ictus, i farmaci pre-ictus. La gravità dell’ictus viene misurata utilizzando la NIHSS al basale e ai follow-up a 1, 7 e 90 giorni, e la disabilità post-ictus mediante la scala di Rankin modificata (mRS) somministrata a 3 mesi tramite visita o intervista telefonica.

Valutazione neuroradiologica:

La valutazione neuroradiologica è in cieco rispetto ai dati clinici. L’imaging cerebrale include TC basale semplice e, quando clinicamente indicato, angiografia TC multifase e perfusione TC al basale. Vengono eseguite TC a 24 h e RM senza contrasto a 5 giorni (includendo sequenze di imaging pesato in diffusione (DWI), coefficiente di diffusione apparente (ADC), fluid-attenuated inversion recovery (FLAIR) e fast field echo (FFE)).

I segni ischemici precoci (punteggio Alberta Stroke Programme Early CT [ASPECTS]), la presenza e la gravità della malattia dei piccoli vasi, la presenza e la classificazione di CE e HT vengono valutati da due neuroradiologi sulle scansioni TC basali e di follow-up.

Il CE viene classificato secondo i criteri SITS-ISTR (Safe Implementation of Treatments in Stroke - International Stroke Thrombolysis Register):

COED1 = gonfiore cerebrale focale fino a un terzo dell’emisfero, COED2 = gonfiore cerebrale focale maggiore di un terzo dell’emisfero, COED3 = gonfiore cerebrale con spostamento della linea mediana, NONE = assenza di edema cerebrale.

L’HT viene valutata secondo la classificazione radiografica ECASS (European Cooperative Acute Stroke Study):

HI-1: Infarto emorragico tipo 1 = piccole petecchie HI-2: Infarto emorragico tipo 2 = petecchie più confluenti PH-1: Ematoma parenchimale tipo 1 = <30% dell’area infartuata con lieve effetto massa PH-2: Ematoma parenchimale tipo 2 = >30% dell’area infartuata con significativo effetto massa I dati di perfusione derivati secondo il protocollo clinico locale vengono valutati da un neuroradiologo esperto per rilevare il volume del core dell’infarto e dell’ipoperfusione.

Inoltre, viene eseguita una caratterizzazione RM dell’edema per differenziare l’edema vasogenico dall’edema citotossico, analizzando le caratteristiche del segnale e la morfologia lesionale.

Viene anche applicato un nuovo metodo per quantificare il gonfiore cerebrale (indotto da CE e HT) e per definire la crescita della lesione e il volume finale dell’infarto, chiamato Distorsione Anatomica (AD).

Due operatori esperti creeranno indipendentemente una mappatura manuale (“maschera”) della lesione ischemica visibile sulla scansione TC a 24 ore. Una “maschera” della lesione sarà definita da un operatore anche sulla scansione RM (Magnetic Resonance Imaging) a 5 giorni (utilizzando la sequenza DWI). Eventuali discrepanze saranno risolte da un neuroradiologo separato. Per questo processo, verrà utilizzato FSLeyes, un software incluso nel software FSL (FMRIB [Functional Magnetic Resonance Imaging of the Brain] Software Library v6.0, creato dall’Analysis Group, FMRIB, Oxford, UK) che offre la possibilità di generare una maschera lesionale tridimensionale per ogni paziente, coprendo il tessuto infartuato su tutte le sezioni TC. Lesioni ischemiche pregresse/non acute (già presenti sulla TC basale) non saranno incluse nelle maschere.

L’AD sarà valutata confrontando la TC basale con le scansioni TC a 24 ore e RM a 5 giorni. I passaggi necessari per ottenere questa misurazione includono la delineazione della lesione ischemica visibile sulle scansioni di follow-up utilizzando una “maschera” (descritta prima) e la registrazione, una procedura che consente un confronto accurato tra diverse immagini del cervello, anche in tempi diversi e in individui diversi. L’AD può essere calcolata confrontando i due possibili approcci di registrazione e in particolare quantificando la differenza tra le maschere lesionali elaborate tramite registrazione Lineare e Non Lineare secondo il metodo descritto da Harston nel 2018. Tutta l’elaborazione e l’analisi delle immagini sarà eseguita utilizzando il software FSL (FMRIB Software Library v6.0, creato dall’Analysis Group, FMRIB, Oxford, UK), un software ad accesso gratuito sviluppato da un gruppo di ricerca dell’Università di Oxford. Sottraendo l’AD dal volume totale della lesione, i ricercatori possono ottenere il volume dell’infarto corretto.

Protocollo di laboratorio:

Le misurazioni dei biomarcatori sono in cieco rispetto ai dati clinici. In tutti i pazienti, i seguenti livelli sierici di biomarcatori legati all’infiammazione, alla disfunzione della barriera emato-encefalica e al danno da riperfusione, vengono misurati all’arrivo e dopo 24 ore.

Possono essere divisi in tre gruppi in base al tipo e alla velocità della tecnica di misurazione:

• molecole rapidamente disponibili: alfa 2 macroglobulina (A2M); proteina Sierica Amiloide A (SAA); Aptoglobina (Hp); proteina C reattiva ad alta sensibilità (hsCRP); Enolasi neuro-specifica (NSE); S100Beta (S100B)
• biomarcatori che richiedono tempi più lunghi per essere misurati: citochine e chemochine pro- e anti-infiammatorie, metalloproteasi della matrice (MMPs) e i loro inibitori (TIMPs), fattore di von Willebrand (vWF), marcatori di disfunzione endoteliale e proteine delle giunzioni strette.
• Biomarcatori metabolomici e lipoproteomici

Tutti i dati sono riportati in un apposito Case report form (CRF).

Misura dell’esito

Misura dell’Esito Primario:

1. Espansione dell’infarto, Trasformazione Emorragica ed Edema Cerebrale

   Misura dell’Esito Secondario:

2. Esito funzionale L’esito funzionale sarà valutato misurando la scala di Rankin modificata 3 mesi dopo l’esordio dell’ictus ischemico acuto.

Piano di analisi statistica:

Saranno condotte analisi di regressione lineare univariata per valutare l’associazione tra ogni esito radiologico primario e variabili basali selezionate (inclusi i biomarcatori circolanti). Le variabili indipendenti associate all’esito nell’analisi univariata saranno incluse in modelli multivariati.

In un’altra analisi, saranno creati modelli di regressione logistica univariata per valutare l’associazione tra biomarcatori circolanti e radiologici basali e variabili cliniche e il punteggio mRS dicotomizzato registrato a tre mesi. I fattori di rischio risultati significativi in un’analisi univariata entreranno in un modello di regressione logistica multipla con un criterio di selezione all’indietro.

AMBITO PRECLINICO

Dichiarazione etica ricerca preclinica:

Tutte le procedure che coinvolgono i topi sono eseguite in conformità alle normative dell’autorizzazione n. 723/2019 del Ministero della Salute italiano.

I topi sono alloggiati in gabbie di plastica trasparente sotto un ciclo luce/buio di 12 h e hanno accesso ad libitum ad acqua e cibo. I ricercatori utilizzano una linea di topi transgenici, C57BL/6J-Tg(Thy1-EGFP)MJrs/J, dei Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine USA).

Modello murino di occlusione e ricanalizzazione dell’Arteria Cerebrale Media (MCA):

In questo progetto, viene applicato un nuovo metodo di occlusione fototrombotica transitoria dell’MCA distale sviluppato dal nostro gruppo. In breve, l’occlusione fototrombotica dell’MCA viene eseguita irradiando l’MCA distale con un laser verde focalizzato, dopo un’iniezione intraperitoneale del colorante fotosensibile Rosa Bengala. A tempi selezionati dopo l’occlusione dell’MCA (30 min, 60 min, 90 min), la ricanalizzazione viene eseguita irradiando l’MCA distale occlusa con un LED Ultravioletto (UV) in grado di rompere i legami di fibrina all’interno del coagulo.

Imaging in vivo a due fotoni di dendriti e vascolarizzazione:

Viene investigata la plasticità strutturale degli assoni e dei dendriti nella fase acuta dopo l’ictus rispetto alla condizione pre-ictus. Nei topi Thy1-GFP viene eseguita una finestra cranica sull’area peri-infartuale per consentire un accesso ottico permanente alla corteccia del topo. I vasi sanguigni superficiali della finestra cranica sono usati come punto di riferimento per ritrovare la stessa regione della corteccia in diverse sessioni di imaging, eseguendo un’indagine longitudinale del turnover dei terminali sinaptici e dell’orientamento dei processi neuronali. Inoltre, viene caratterizzata la permeabilità vascolare a livello capillare. A questo scopo, viene eseguita un’iniezione sistemica di un colorante fluorescente (ad es. Texas Red Dextran, Thermo Fisher Scientific, USA) nella vena caudale dei topi immediatamente prima della sessione di imaging. Questo colorante è vitale per diverse ore dopo l’iniezione e diffonde nel parenchima solo se e dove si verifica extravasazione. Quindi, vengono acquisiti stack di imaging della vascolarizzazione marcata ogni 5 minuti da subito fino a 30 minuti dopo l’iniezione. Per valutare la permeabilità dei vasi sanguigni in vivo, vengono eseguiti i valori medi di fluorescenza all’interno di una Regione di Interesse quadrata centrata all’interno o immediatamente all’esterno di un vaso sanguigno e si ripete la misurazione nella stessa posizione in diversi punti temporali dopo l’iniezione. La permeabilità κ(t) sarà calcolata secondo la seguente formula descritta da Nhan nel 2013: [κ(t) = (dIe/dt)/[(Ii(t)/0.55)-(Ie(t)/(Ve/Vi)].

Edema:

24 ore dopo l’induzione dell’ictus, il contenuto di acqua cerebrale, come misura indiretta dell’edema cerebrale, viene calcolato nei topi sacrificati, secondo Kenne e collaboratori. Il cervello viene diviso lungo la linea mediana e i tessuti controlaterale e ipsilaterale vengono pesati subito dopo la rimozione per ottenere il peso umido (WW). I tessuti vengono essiccati a 60°C per 72 ore e pesati per ottenere il peso secco (DW). Il contenuto di acqua viene calcolato come percentuale del peso umido; % contenuto di acqua = [(WW-DW)/(WW)]*100.

Indagine sui biomarcatori circolanti:

Per testare in diversi punti temporali (pre-ictus, basale e 24 ore dopo l’occlusione) gli stessi biomarcatori ematici valutati nei pazienti, il sangue viene prelevato attraverso il seno retro-orbitale in topi anestetizzati.

Analisi statistiche:

Il campione sarà diviso in tre gruppi sperimentali (Sham, Non Ricanalizzato e Ricanalizzato). Per la dimensione del campione, i ricercatori utilizzeranno il test ANOVA (effetti fissi, omnibus, a una via) e i seguenti dati: 3 gruppi sperimentali, dimensione dell’effetto f = 0.5, α = 0.05, Potenza = 0.8 (software utilizzato G * Power, versione 3.1.9.2, Franz Faul, Università di Kiel, Germania). I dati dei topi dei tre gruppi saranno confrontati in diversi punti temporali (pre-ictus, basale e 24 dopo l’ictus). Verrà eseguita un’analisi della varianza (ANOVA) a una via a misure ripetute sui dati di imaging a due fotoni per valutare il turnover sinaptico e la permeabilità della barriera emato-encefalica dei vasi sanguigni corticali in diversi punti temporali. I dati saranno forniti come media ± errore standard della media.

Finanziamenti:

• Regione Toscana “Bando Salute 2018”;
• #NEXTGENERATIONEU (NGEU) e finanziato dal Ministero dell’Università e della Ricerca (MUR), Piano Nazionale di Ripresa e Resilienza (PNRR), progetto MNESYS (PE0000006) - Un approccio integrato multiscala allo studio del sistema nervoso in salute e malattia (DN. 1553 11.10.2022).