Biomarqueurs humides et secs pour prédire les lésions secondaires dans l'AVC : du laboratoire au chevet du patient - L'étude NIMBLE (NIMBLE)

CONTEXTE La croissance de l'infarctus (IG), la transformation hémorragique (HT) et l'œdème cérébral (CE) sont des facteurs clés associés à un pronostic négatif chez les patients victimes d'un AVC ischémique, malgré le succès de la recanalisation. La reperfusion futile et la lésion de reperfusion sont liées à ces phénomènes nocifs, mais leurs mécanismes restent largement incompris et, par conséquent, ils sont difficiles à prédire et à prévenir. Diverses études ont montré que certains biomarqueurs circulants sont associés au développement de l'IG, de la HT et du CE.

L'étude NIMBLE (Intégration de nouvelles Mesures de NeuroImagerie et de biomarqueurs circulants pour la prédiction des lésions secondaires suite à un AVC : du laboratoire au lit du patient) est un projet translationnel incluant une recherche clinique chez l'homme et une étude expérimentale chez l'animal. Elle a pour objectif d'étudier les facteurs potentiels contribuant à l'IG, la HT et le CE après l'ischémie, en étudiant les biomarqueurs circulants par rapport aux anomalies de neuroimagerie et au devenir fonctionnel chez l'homme. Chez la souris, les biomarqueurs circulants sont étudiés par rapport à la réorganisation neuronale au niveau cellulaire et subcellulaire et à l'évaluation expérimentale du CE.

CADRE CLINIQUE

Conception de l'étude :

Étude observationnelle prospective, longitudinale, de suivi, monocentrique, incluant une série consécutive de patients présentant un AVC ischémique aigu antérieur dans les 12 heures suivant l'apparition des symptômes aux urgences, traités ou non par des thérapies de revascularisation.

Tous les patients subissent une évaluation de neuroimagerie et un prélèvement sanguin pour le dosage de plusieurs biomarqueurs circulants sériques (voir détails ci-dessous).

Le recrutement des patients s'est déroulé du 24/04/2021 au 30/06/2023 pour un total de 213 patients, âge médian [IQR (Intervalle Interquartile)] 80 [16] ans, 46 % de femmes, score NIHSS (Échelle d'AVC des Instituts Nationaux de la Santé) médian de base [IQR] 10 [3].

Méthodologie de travail :

Évaluation clinique :

Un ensemble complet de données cliniques incluant les facteurs de risque d'AVC, le traitement de l'AVC aigu, les médicaments avant l'AVC est enregistré pour chaque patient. La sévérité de l'AVC est mesurée en utilisant le NIHSS à l'inclusion et aux suivis à 1, 7 et 90 jours, et l'incapacité post-AVC par l'échelle de Rankin modifiée (mRS) administrée à 3 mois par visite ou entretien téléphonique.

Évaluation neuroradiologique :

L'évaluation neuroradiologique est réalisée en aveugle des données cliniques. L'imagerie cérébrale comprend un scanner simple de base et, si cliniquement indiqué, une angiographie CT (Tomodensitométrie) multiphasique et une perfusion CT au départ. Un scanner à 24 h et une IRM sans contraste à 5 jours (incluant les séquences d'imagerie de diffusion (DWI), de coefficient de diffusion apparent (ADC), de récupération d'inversion atténuée par le liquide (FLAIR) et d'écho de champ rapide (FFE)) sont réalisés.

Les signes ischémiques précoces (score ASPECTS [Alberta Stroke Programme Early CT]), la présence et la sévérité de la maladie des petits vaisseaux, la présence et le degré du CE et de la HT sont évalués par deux neuroradiologues sur les scanners de base et de suivi.

Le CE est classé selon les critères SITS-ISTR (Registre International de Thrombolyse dans l'AVC - Mise en Œuvre Sûre des Traitements dans l'AVC) :

COED1 = gonflement cérébral focal jusqu'à un tiers de l'hémisphère, COED2 = gonflement cérébral focal supérieur à un tiers de l'hémisphère, COED3 = gonflement cérébral avec déviation de la ligne médiane, NONE = absence d'œdème cérébral.

La HT est évaluée selon la classification radiographique ECASS (Étude Coopérative Européenne sur l'AVC Aigu) :

HI-1 : Infarctus hémorragique type 1 = petites pétéchies HI-2 : Infarctus hémorragique type 2 = pétéchies plus confluentes PH-1 : Hématome parenchymateux type 1 = <30% de la zone infarcte avec effet de masse léger PH-2 : Hématome parenchymateux type 2 = >30% de la zone infarcte avec effet de masse significatif Les données de perfusion obtenues selon le protocole clinique local sont évaluées par un neuroradiologue expert pour détecter le cœur de l'infarctus et les volumes d'hypoperfusion.

De plus, une caractérisation de l'œdème par IRM est réalisée pour différencier l'œdème vasogénique de l'œdème cytotoxique, en analysant les caractéristiques du signal et la morphologie lésionnelle.

Une nouvelle méthode pour quantifier le gonflement cérébral (induite par le CE et la HT) et définir la croissance de la lésion et le volume final de l'infarctus, appelée Distorsion Anatomique (AD), est également appliquée.

Deux opérateurs experts créeront indépendamment un tracé manuel ("masque") de la lésion ischémique visible sur le scanner à 24 heures. Un "masque" de lésion sera défini par un opérateur également sur l'IRM (Imagerie par Résonance Magnétique) à 5 jours (en utilisant la séquence DWI). Toute divergence sera résolue par un neuroradiologue distinct. Pour ce processus, FSLeyes sera utilisé, un logiciel inclus dans le logiciel FSL (Bibliothèque Logicielle FMRIB [Imagerie par Résonance Magnétique Fonctionnelle du Cerveau] v6.0, créé par le Groupe d'Analyse, FMRIB, Oxford, Royaume-Uni) qui offre la possibilité de générer un masque de lésion tridimensionnel pour chaque patient, couvrant le tissu infarci sur toutes les sections du scanner. Les lésions ischémiques antérieures/non aiguës (déjà présentes sur le scanner de base) ne seront pas incluses dans les masques.

L'AD sera évaluée en comparant le scanner de base avec les scanners à 24 heures et l'IRM à 5 jours. Les étapes nécessaires pour obtenir cette mesure incluent le tracé de la lésion ischémique visible sur les scanners de suivi en utilisant un "masque" (décrit précédemment) et l'enregistrement, une procédure qui permet une comparaison précise entre différentes images du cerveau, même à différents moments et chez différents individus. L'AD peut être calculée en comparant les deux approches d'enregistrement possibles et en particulier en quantifiant la différence entre les masques de lésion traités par enregistrement Linéaire et Non-Linéaire selon la méthode décrite par Harston en 2018. Tous les traitements et analyses d'image seront réalisés en utilisant le logiciel FSL (Bibliothèque Logicielle FMRIB v6.0, créée par le Groupe d'Analyse, FMRIB, Oxford, Royaume-Uni), un logiciel en libre accès développé par un groupe de recherche de l'Université d'Oxford. En soustrayant l'AD du volume total de la lésion, les investigateurs peuvent obtenir le volume corrigé de l'infarctus.

Protocole de laboratoire :

Les mesures des biomarqueurs sont réalisées en aveugle des données cliniques. Chez tous les patients, les niveaux sériques suivants de biomarqueurs liés à l'inflammation, à la rupture de la barrière hémato-encéphalique et à la lésion de reperfusion, sont mesurés à l'arrivée et après 24 heures.

Ils peuvent être divisés en trois groupes selon le type et la vitesse de la technique de mesure :

• molécules rapidement disponibles : alpha 2 macroglobuline (A2M) ; Protéine Sérique Amyloïde A (SAA) ; Haptoglobine (Hp) ; Protéine C Réactive haute sensibilité (hsCRP) ; Enolase spécifique des neurones (NSE) ; S100Beta (S100B)
• biomarqueurs nécessitant des temps de mesure plus longs : cytokines et chimiokines pro- et anti-inflammatoires, métalloprotéases matricielles (MMPs) et leurs inhibiteurs (TIMPs), facteur de von Willebrand (vWF), marqueurs de dysfonction endothéliale et protéines des jonctions serrées.
• biomarqueurs métabolomiques et lipoprotéomiques

Toutes les données sont rapportées dans un Cahier d'Observation Clinique (COC) dédié.

Mesure des résultats

Mesure de Résultat Principal :

1. Croissance de l'infarctus, Transformation Hémorragique et Œdème Cérébral

   Mesure de Résultat Secondaire :

2. Résultat fonctionnel Le résultat fonctionnel sera évalué en mesurant l'échelle de Rankin modifiée 3 mois après le début de l'AVC ischémique aigu.

Plan d'analyse statistique :

Des analyses de régression linéaire univariée seront menées pour évaluer l'association entre chaque résultat radiologique principal et des variables de base sélectionnées (incluant les biomarqueurs circulants). Les variables indépendantes associées au résultat en analyse univariée seront incluses dans des modèles multivariés.

Dans une autre analyse, des modèles de régression logistique univariée seront créés pour évaluer l'association entre les biomarqueurs circulants et radiologiques de base et les variables cliniques et le score mRS dichotomisé enregistré à trois mois. Les facteurs de risque trouvés significatifs en analyse univariée entreront dans un modèle de régression logistique multiple avec un critère de sélection rétrograde.

CADRE PRÉCLINIQUE

Déclaration éthique recherche préclinique :

Toutes les procédures impliquant des souris sont réalisées conformément aux règlements de l'autorisation n° 723/2019 du Ministère italien de la Santé.

Les souris sont hébergées dans des cages en plastique transparent sous un cycle lumière/obscurité de 12 h et ont un accès ad libitum à l'eau et à la nourriture. Les investigateurs utilisent une lignée de souris transgéniques, C57BL/6J-Tg(Thy1-EGFP)MJrs/J, de Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine, USA).

Modèle murin d'occlusion et de recanalisation de l'Artère Cérébrale Moyenne (ACM) :

Dans ce projet, une nouvelle méthode d'occlusion photothrombotique distale transitoire de l'ACM développée par notre groupe est appliquée. Brièvement, l'occlusion photothrombotique de l'ACM est réalisée en irradiant l'ACM distale avec un laser vert focalisé, après une injection intrapéritonéale du colorant photosensible Rose Bengale. À des temps sélectionnés après l'occlusion de l'ACM (30 min, 60 min, 90 min), la recanalisation est réalisée en irradiant l'ACM distale occluse avec une LED Ultraviolette (UV) capable de rompre les liaisons de fibrine à l'intérieur du caillot.

Imagerie biphotonique in vivo des dendrites et de la vascularisation :

La plasticité structurelle des axones et des dendrites dans la phase aiguë après l'AVC par rapport à la condition pré-AVC est étudiée. Chez les souris Thy1-GFP, une fenêtre crânienne sur la zone péri-infarctus est réalisée pour permettre un accès optique permanent au cortex de la souris. Les vaisseaux sanguins superficiels de la fenêtre crânienne sont utilisés comme repère pour retrouver la même région du cortex dans différentes sessions d'imagerie, réalisant une investigation longitudinale du renouvellement des terminaisons synaptiques et de l'orientation des processus neuronaux. De plus, la perméabilité vasculaire au niveau capillaire est caractérisée. À cette fin, une injection systémique d'un colorant fluorescent (par exemple, Dextran Texas Red, Thermo Fisher Scientific, USA) dans la veine caudale des souris juste avant la session d'imagerie est réalisée. Ce colorant est vital pendant plusieurs heures après l'injection et diffuse dans le parenchyme uniquement si et où une extravasation se produit. Ensuite, des empilements d'imagerie de la vascularisation marquée sont acquis toutes les 5 minutes, de immédiatement à 30 minutes après l'injection. Pour évaluer la perméabilité des vaisseaux sanguins in vivo, les valeurs moyennes de fluorescence dans une Région d'Intérêt carrée centrée soit à l'intérieur soit juste à l'extérieur d'un vaisseau sanguin et la mesure est répétée au même endroit à différents temps après l'injection. La perméabilité κ(t) sera calculée selon la formule suivante décrite par Nhan en 2013 : [κ(t) = (dIe/dt)/[(Ii(t)/0.55)-(Ie(t)/(Ve/Vi)].

Œdème :

24 heures après l'induction de l'AVC, la teneur en eau du cerveau, comme mesure indirecte de l'œdème cérébral, est calculée chez les souris sacrifiées, selon Kenne et collaborateurs. Le cerveau est divisé le long de la ligne médiane et les tissus controlatéraux et ipsilatéraux sont pesés immédiatement après le prélèvement pour obtenir le poids humide (WW). Les tissus sont séchés à 60°C pendant 72 heures et pesés pour obtenir le poids sec (DW). La teneur en eau est calculée en pourcentage du poids humide ; % teneur en eau = [(WW-DW)/(WW)]*100.

Investigation des biomarqueurs circulants :

Afin de tester à différents temps (pré-AVC, base, et 24 heures après l'occlusion) les mêmes biomarqueurs sanguins évalués chez les patients, le sang est prélevé par le sinus rétro-orbitaire chez des souris anesthésiées.

Analyses statistiques :

L'échantillon sera divisé en trois groupes expérimentaux (Sham, Non-Recanalisé, et Recanalisé). Pour le dimensionnement de l'échantillon, les investigateurs utiliseront le test ANOVA (effets fixes, omnibus, unidirectionnel) et les données suivantes : 3 groupes expérimentaux, taille d'effet f = 0,5, α = 0,05, Puissance = 0,8 (logiciel utilisé G*Power, version 3.1.9.2, Franz Faul, Université de Kiel, Allemagne). Les données des souris des trois groupes seront comparées à différents temps (pré-AVC, base, et 24 après l'AVC). Une analyse de variance (ANOVA) à mesures répétées unidirectionnelle sera réalisée sur les données d'imagerie biphotonique afin d'évaluer le renouvellement synaptique et la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique des vaisseaux sanguins corticaux à différents temps. Les données seront données sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne.

Financements :

• Région Toscane "Bando Salute 2018";
• #NEXTGENERATIONEU (NGEU) et financé par le Ministère de l'Université et de la Recherche (MUR), Plan National de Relance et de Résilience (PNRR), projet MNESYS (PE0000006) - Une approche intégrée multiscalaire pour l'étude du système nerveux en santé et maladie (DN. 1553 11.10.2022).