仕上げ用クリアアライナー辺縁終止デザインが矯正治療中の歯周ポケット内細菌叢に及ぼす影響：分割口腔研究。 (PATHO-ALIGN)

- 背景と理論的根拠

クリアアライナー療法は矯正歯科で広く使用されています。 仕上げ段階では、2種類のトリミングライン設計が一般的に採用されています。 歯肉縁上設計は、遊離歯肉縁から約2mm根尖側に位置する直線水平カットを使用します：アライナー縁は約2mmの歯肉組織を覆い直接接触しますが、歯肉溝内には侵入しません。 歯肉縁接合フェストゥーンド設計は、遊離歯肉縁の自然な輪郭に正確に沿うスキャロップカットを使用し、歯肉組織を覆わず、歯肉溝内に入らずに歯肉縁で終端します。 2つの設計は、歯肉縁との関係において根本的に異なります。 歯肉縁上設計は、歯肉溝入口部に半閉鎖的な微小環境を作り出します：2mmの歯肉組織を覆うことで、アライナーは唾液と大気中の酸素が歯肉溝入口部領域にアクセスするのを制限します。 唾液クリアランスの低下と酸素分圧の減少は、歯周環境における嫌気性細菌増殖を促進する確立された条件です。 アライナー縁による2mmの歯肉組織覆いが、歯肉溝内酸素分圧や唾液クリアランスに測定可能な変化を生じさせるのに十分かどうかは直接的に実証されておらず、調査中の生物学的仮説を構成します。 歯肉縁接合設計は、その縁で歯肉輪郭に従い、歯肉溝入口部を唾液と酸素によりアクセスしやすくし、嫌気性コロニー形成に対してより不利な条件を維持する可能性があります。 これらの微小環境の違いは、公表された研究では調査されていません。 アライナー療法を受けている患者において、トリミングライン形状が歯肉縁下歯周細菌叢組成に影響を与えるかどうかを調べた先行研究はありません。

• 研究デザイン

これは前向き縦断的、個人内（スプリットマウス）介入研究です。 各参加者は、両方のトリミングライン設計を同時に受けます：片方の歯列弓には歯肉縁上設計、対側の歯列弓には歯肉縁接合フェストゥーンド設計。 スプリットマウスデザインは、全身的健康状態、口腔衛生、唾液組成、およびベースライン微生物学的状態における個人間変動を制御します。 アライナー材料（CA Pro tri-layer, SCHEU-DENTAL GmbH, イーザーローン, ドイツ; CEマーク付き熱可塑性プラスチック）は両設計で同一です；トリミングライン形状のみが異なります。

• 割付規則（非ランダム化）

割付は、登録前に文書化された事前指定階層規則に従います：

1. 主要基準：計画された歯牙圧下量が大きい歯列弓（mm, 製作前のデジタル治療設定から）が歯肉縁上設計を受け、垂直方向の力伝達に対する臨床的適応と一致します。

2. タイブレーカー（両歯列弓で計画圧下量が等しいかゼロの場合）：登録順序における事前指定系統的交互順序。 この基準を満たす最初の参加者は上顎弓に歯肉縁上設計を受け、2番目は下顎弓に受け、以下同様に続きます。 これにより、歯列弓レベル分布のおおよそ50/50バランスが確保され、歯列弓レベルの交絡を防ぎます。 歯列弓ごとの計画圧下量は、すべての統計モデルで連続共変量として記録されます。

   - ベースライン評価（T0）

   単一のプールされたベースライン検体が、歯列弓ごとに3つの指標部位をサンプリング（合計6本のペーポイント：歯列弓ごとに3本）し、T0で1本のエッペンドルフチューブに結合して収集されます。 これはスプリットマウスデザインの基本的仮定によって正当化されます：ベースラインで臨床的に健康な歯周状態の参加者（包含基準：プロービングデプス3mm以下、指標部位でBOPなし）では、介入前には臨床的に意味のある歯列弓特異的微生物学的差異は期待されません。 歯周的に健康な個人の歯肉縁下マイクロバイオームは、両歯列弓で共有される共通唾液貯留層を反映します。 T0検体は全体的なベースライン病原体状態を特徴づけます。 主要な群間比較は、歯列弓特異的検体が利用可能なT1およびT2でのみ実施されます。

   - 検体総数：175本のPCRチューブ（評価可能参加者35名 × 参加者あたり5本のチューブ：T0でプール1本 + T1で歯列弓特異的2本 + T2で歯列弓特異的2本）。 合計ペーポイント：525本（35 × 15：T0で6本[歯列弓ごとに3本 × 2歯列弓をプール] + T1で歯列弓ごとに3本 × 2歯列弓 + T2で歯列弓ごとに3本 × 2歯列弓）。 PCR分析の単位は、時点ごと歯列弓あたり1つの結果のままです；歯列弓ごとに3本のペーポイントをプールすることで、チューブあたりの生物学的材料が増加し、PCR感度が向上しますが、分析単位や検出力計算は変更されません。

   - サンプル収集手順

   すべての収集は標準化された絶食条件下（à jeun）で実施されます：参加者は、収集の少なくとも8時間前（一晩のアライナー装着）に、飲食（水は許可）、歯磨き、マウスリンスの使用、およびアライナーの取り外しを控えます。 収集は午前中に行われます。 各来院時、歯肉縁上プラークは、歯肉溝内に入らずに滅菌キュレットで各指標歯から優しく除去され、その領域は綿巻きで隔離されます。 3本の滅菌ペーポイント（サイズ#25, Sacace PeriodontScreen Real-TMキットで指定通り）が、歯列弓ごとの3つの指標部位に順次挿入され、それぞれ10-20秒間保持されます。 同じ歯列弓からの3本のペーポイントは、直ちに単一のエッペンドルフチューブ（200 ul滅菌PBS）にプールされ、時点ごと歯列弓あたり1つの生物学的検体が得られます。

   - 指標部位選択（事前指定、T0で記録、T1およびT2で変更なし）：主要規則：各歯列弓内で最大プロービングデプスを持つ3つの部位が指標部位として選択され、それらの解剖学的領域（前歯部、小臼歯部、大臼歯部）に関係なく選択されます。 これらが最も深い場合、3つの部位すべてが同じ領域にあっても構いません。 タイブレーカー - 上顎弓（2つ以上の部位が最大プロービングデプスを共有し、3つの一意の最深部位を区別できない場合）：歯1.6の近心 + 歯2.6の近心 + 歯1.1の中央。 この選択は、右上第一大臼歯と右上中切歯から歯肉縁下検体を収集したLombardoら（2021）で使用された上顎サンプリング部位と一致します。 タイブレーカー - 下顎弓：歯4.6の近心 + 歯3.6の近心 + 歯4.1の中央。 この規則は、研究担当者が事前に定義したもので、上顎タイブレーカーの解剖学的鏡像（臼歯-臼歯-切歯）であり、対応する位置で同じ歯種を使用して下顎弓に適用されます。 矯正患者における歯肉縁下細菌叢に関する同一の下顎タイブレーカー規則を使用した公表研究は確認されていません；したがって、この規則は事前指定され、研究担当者定義のプロトコル決定としてここに文書化されます。 歯列弓ごとの同じ3つの指標部位がT1およびT2で使用されます。

   - 遵守モニタリングと脱落プロトコル

   アライナー装着遵守状況（目標1日22時間以上）は、各研究来院時に自己報告により評価されます。 2回以上の連続来院で1日22時間未満の遵守を報告した参加者は、研究から除外され、そのデータはプロトコル遵守分析から除外されます。 報告された非遵守の単一の来院は、口頭での強化を引き起こし、プロトコル逸脱として記録されます。 すべての登録参加者は、遵守状況に関係なく、intent-to-treat記述に含まれます。 T0では：6本のペーポイント（歯列弓ごとに3本）がすべて1本のエッペンドルフチューブ（200 ul滅菌PBS）にプールされます - ベースラインで参加者あたり合計1本のチューブ。 T1およびT2では：歯列弓ごとに3本のペーポイントが、歯列弓ごとに別々のエッペンドルフチューブ（歯肉縁上設計歯列弓と歯肉縁接合設計歯列弓）にプールされ、参加者コード、時点、歯列弓指定でラベル付けされます - 時点ごと参加者あたり2本のチューブ。 チューブは、シビウのAorys Clinicで2-4時間以内に-20℃で凍結されます。 サンプルは、断熱容器と凍結ジェルパックで（輸送約2-2.5時間）Târgu MureșのUMFST微生物学部門にバッチで輸送されます。 分析前の-20℃での保管は、歯肉縁下細菌DNA保存の検証済みプロトコルと一致します。

   - 実験室分析

   サンプルは、Târgu MureșのGeorge Emil Palade医学・薬学・科学・技術大学微生物学部門およびMureș郡立臨床病院で、PeriodontScreen Real-TMキット（Sacace Biotechnologies Srl, Via Scalabrini 44, 22100 コモ, イタリア; REF T01707-96-S; CEマーク付きIVD）を使用して分析されます。 DNA抽出：ペーポイントをPBS中でボルテックス（30秒）して細菌を溶出します。 懸濁液を遠心分離（12,000 × g, 2-3分）、上清を除去し、市販抽出キット（QIAamp DNA Mini Kit, Qiagen, または同等の検証済みキット）を使用してペレットから細菌DNAを抽出します（メーカー指示通り）。 リアルタイムPCR：PeriodontScreen Real-TMアッセイは、特定の蛍光プローブ（FAMチャネル, 40サイクル; HEXチャネル内部対照）を使用して、7種の歯周病原体種を検出・定量します。 キット検証済み臨床的有意性閾値：A. actinomycetemcomitans 10^4コピー/反応以上; P. gingivalis, T. forsythia, T. denticola 10^5以上; P. endodontalis, F. nucleatum, P. intermedia 10^6以上。 FAM Ctが35未満の場合、特定の病原体に対して結果は陽性です。 FAM Ctが35未満（HEX Ct値に関係なく）の場合、またはHEX Ctが35未満の場合、結果は有効と見なされます。 FAM CtとHEX Ctの両方が35より大きいか存在しない場合、結果は無効と見なされ、抽出失敗またはPCR阻害の可能性を示すため、繰り返す必要があります。 実験室担当者は、どの歯列弓がどのトリミングライン設計に対応するか知らされずに、コード化されたチューブ（参加者コード、歯列弓、時点）を受け取ります。 さらに、サンプル収集者（一般歯科専門医および矯正歯科レジデント、治療担当医とは別）は、すべての時点で歯列弓割付について完全に盲検化されています：収集者は、各歯列弓にどのトリミングライン設計が割り当てられているかを知らずに、すべての歯肉縁下サンプリングを実施します。 治療担当医（PI）が割付キーを保持し、すべてのPCR分析が完了した後にのみ公開されます。

   - 統計分析

   確認主要分析：確認エンドポイントは、T2（8週）における歯列弓レベル病原体負荷スコア（0-7）です。 単一のWilcoxon符号順位検定（対応、両側、α = 0.05）が、T2における歯肉縁上設計歯列弓スコアと歯肉縁接合設計歯列弓スコアを比較します。 この検定が選択されたのは、結果が対応スプリットマウスデザインにおける離散順序カウント（整数0-7）であり、ノンパラメトリック対応比較が適切で分布仮定を必要としないためです。 T2での単一の確認検定が事前指定され、多重性補正なしでタイプIエラー率をα = 0.05に制御します。

   - T1での支持的分析：Wilcoxon符号順位検定は、観察された効果の時間的パターンを特徴づけるための支持的・非確認的分析として、T1（4週）でも適用されます。 T1の結果は記述的に報告されます；T1検定から確認的推論は導き出されません。

   調整分析：一般化推定方程式（GEE）モデルが、T1およびT2における歯列弓レベル病原体負荷スコアに適合されます。以下の仕様で：(1) 応答：歯列弓レベル病原体負荷スコア（0-7）; (2) リンク関数：恒等; (3) 分布族：ガウス; (4) 作業相関構造：交換可能、ベースライン後の2時点で被験者内相関が時間間で等しいと仮定するのに適切; (5) 共変量：トリミングライン設計（二値：歯肉縁上設計 vs. 歯肉縁接合設計）、時点（カテゴリカル：T1, T2）、歯列弓ごとの計画圧下量（連続, mm）。 設計 × 時点交互作用項が検定され、トリミングライン設計の効果がT1とT2間で異なるかどうか評価されます；交互作用項が統計的に有意でない場合（p > 0.10）、削除され、主効果のみのモデルが報告されます。 GEEモデルは、時点間の被験者内相関を考慮し、事前指定非ランダム割付変数（計画圧下量）を調整します。 GEE分析は、R（バージョン4.0以降）のgeepackパッケージを使用して実施されます。

   • 探索的分析：McNemar検定で、T1およびT2における2設計間の歯列弓レベルレッドコンプレックス陽性率（二値結果）を比較します。 記述的にのみ解釈されます；確認的推論は導き出されません。 この探索的結果に対する予測検出力は約22%であり、歯周的に健康な参加者における同時レッドコンプレックス陽性率の低い予想によるものです。 この低い検出力は認識されており、結果はそれに応じて探索的として登録されます。
   • 欠測データ：欠測結果データは完全ケース分析で扱われます。 T1およびT2の両方で評価可能データを持つ参加者が、確認分析で使用されるプロトコル遵守母集団を構成します。 T0後に脱落した参加者を含むすべての登録参加者は、intent-to-treat母集団で記述されます；予測脱落率10%以下を考慮して、主要分析に対して代入は実施されません。
   • ソフトウェア：主要確認分析（Wilcoxon符号順位検定）および記述統計は、GraphPad Prism 8（バージョン8.0.2）を使用して実施されます。 GEEモデルはR（バージョン4.0以降）で実施されます。 報告されるすべてのp値は両側です。 中間分析は計画されていません。
   • サンプルサイズの正当化

   サンプルサイズは、対応被験者内（スプリットマウス）デザインに対してモンテカルロシミュレーション（10,000回反復）によって決定されました。 シミュレーションパラメータは、トリミングライン設計の歯肉縁下病原体負荷への影響に関する公表されたパイロットデータが特にないため、保守的に選択されました：

(1) 歯列弓間の最小臨床的有意差：閾値以上の0.5種、歯肉縁接合設計歯列弓と比較して歯肉縁上設計歯列弓で臨床的有意性閾値を超える追加の病原体種1種を表す; (2) 個々の歯列弓レベルスコアの標準偏差（σ）：0.88、これは対応差の標準偏差（σ_D）が0.964であることを意味します [σ_D = σ × sqrt(2 × (1 - ρ)) = 0.88 × sqrt(1.2) = 0.964]；これは、パイロットデータがない場合の参加者間変動の保守的推定を表します；対応差はほぼ対称（正規周辺分布を持つガウスコピュラ）としてシミュレートされ、Wilcoxon検出力推定の保守的ベースラインとなります; (3) 被験者内相関 ρ = 0.4、スプリットマウス歯周微生物学研究で報告された値と一致; (4) 両側 α = 0.05; (5) Wilcoxon符号順位検定。

シミュレーションは、評価可能参加者数n = 35で、推定検出力 = 82.7%（主要）および82.3%（独立検証）、経験的タイプIエラー = 5.0%をもたらしました。 約10%の予測脱落率（追跡不能、1日22時間アライナー装着遵守不遵守、プロトコル逸脱）を考慮して、登録目標39名が設定されました。

- 限界

PeriodontScreen Real-TMキットは、活動性歯周病集団に対して検証されています；その臨床的有意性閾値は、登録参加者の健康な歯周状態に対して完全に較正されていない可能性があります。 結果はそれに応じて解釈されます。

非ランダム化割付規則は、計画圧下量を超えた歯列弓レベルの生体力学的交絡（例：トルク補正、側方移動）の可能性を導入しますが、これらはGEE共変量によって完全には捕捉されません。 歯列弓ごとの計画圧下量は記録され、GEEモデルで連続共変量として調整されます；他の移動タイプからの残存生体力学的交絡は排除できません。

T0検体はプールされた両側サンプルを表すため、歯列弓特異的ベースライン病原体スコアは利用できません。 したがって、主要分析は、個々の歯列弓レベルベースライン値の調整なしに、T1およびT2における歯列弓特異的スコアを直接比較します。 この限界は、ベースラインでの臨床的に健康な歯周状態（プロービングデプス3mm以下、指標部位でプロービング時出血なし）という包含基準によって軽減され、介入前の既存の歯列弓レベル微生物学的不均衡の確率を最小限に抑えます。