精加工隐形矫治器边缘终止设计对正畸治疗期间龈下牙周微生物群的影响：一项分口研究。 (PATHO-ALIGN)

- 背景与原理

隐形矫治器在正畸治疗中广泛应用。在完成阶段通常采用两种修整线设计。龈上设计采用位于游离龈缘根方约2毫米处的水平直线切割：矫治器边缘覆盖约2毫米的牙龈组织并直接接触，但不进入龈沟。龈缘邻接扇形设计采用精确跟随游离龈缘自然轮廓的扇贝形切割，终止于龈缘而不覆盖牙龈组织且不进入龈沟。这两种设计在与龈缘的关系上存在根本差异。龈上设计在龈沟入口处形成半封闭微环境：通过覆盖2毫米牙龈组织，矫治器限制了唾液和大气氧进入龈沟入口区域。唾液清除减少和氧张力降低是已知有利于牙周环境中厌氧菌生长的条件。矫治器边缘覆盖2毫米牙龈组织是否足以产生可测量的龈沟氧张力或唾液清除变化尚未得到直接证实，这构成了本研究验证的生物学假设。龈缘邻接设计沿龈缘轮廓切割，使龈沟入口更易于接触唾液和氧气，可能维持不利于厌氧菌定植的条件。这些微环境差异尚未在已发表研究中得到探讨。此前尚无研究检验修整线几何形态是否影响接受隐形矫治器治疗患者的龈下牙周微生物群组成。

• 研究设计

这是一项前瞻性、纵向、个体内（分口）干预研究。每位参与者同时接受两种修整线设计：一侧牙弓采用龈上设计，对侧牙弓采用龈缘邻接扇形设计。分口设计控制了全身健康、口腔卫生、唾液成分和基线微生物状态的个体间差异。两种设计使用的矫治器材料相同（CA Pro三层材料，SCHEU-DENTAL GmbH，德国伊瑟隆；CE认证热塑性材料）；仅修整线几何形态不同。

• 分配规则（非随机）

分配遵循入组前预先制定的分层规则：

1. 主要标准：计划牙齿压低幅度较大的牙弓（毫米，来自制作前的数字化治疗方案）接受龈上设计，符合其垂直力传递的临床适应症。

2. 平局规则（双侧牙弓计划压低量相等或为零）：按入组顺序预先设定的系统交替序列。符合此标准的首位参与者在上颌弓接受龈上设计；第二位在下颌弓；依此类推。这确保牙弓水平分布接近50/50平衡，并防止牙弓水平混杂。每个牙弓的计划压低量作为连续协变量记录在所有统计模型中。

   - 基线评估（T0）

   通过每个牙弓三个指标位点采样（共六个纸尖：每牙弓三个）收集单个合并基线样本，在T0时合并至一个Eppendorf管中。这基于分口设计的基本假设：基线时临床牙周健康的参与者（纳入标准：探诊深度≤3毫米，指标位点无探诊出血），在任何干预前预期不存在具有临床意义的牙弓特异性微生物学差异。牙周健康个体的龈下微生物组反映双侧牙弓共享的共同唾液池。T0样本表征总体基线病原体状态。主要组间比较仅在T1和T2进行，此时可获得牙弓特异性样本。

   - 样本总数：175个PCR管（35名可评估参与者×每人5管：T0合并1管+T1牙弓特异性2管+T2牙弓特异性2管）。总纸尖数：525个（35×15：T0 6个[每牙弓3个×2牙弓合并]+T1每牙弓3个×2牙弓+T2每牙弓3个×2牙弓）。PCR分析单位仍为每个时间点每个牙弓一个结果；每个牙弓合并三个纸尖增加了每管的生物材料量并提高了PCR灵敏度，但不改变分析单位或功效计算。

   - 样本收集程序

   所有收集在标准化空腹条件下进行：参与者在收集前至少8小时（夜间佩戴矫治器）禁食、禁饮（允许饮水）、刷牙、使用漱口水及取下矫治器。收集在早晨进行。每次访视时，用无菌刮治器轻柔去除每个指标牙齿的龈上菌斑而不进入龈沟，并用棉卷隔离区域。每个牙弓三个无菌纸尖（尺寸#25，按Sacace PeriodontScreen Real-TM试剂盒规定）依次插入三个指标位点，每个保持10-20秒。同一牙弓的三个纸尖立即合并至单个Eppendorf管（200微升无菌PBS）中，得到每个时间点每个牙弓一个生物样本。

   - 指标位点选择（预先指定，T0时记录，T1和T2不变）：主要规则：选择每个牙弓内探诊深度最大的三个位点作为指标位点，无论其解剖区域（前牙、前磨牙或磨牙）。如果最深位点位于同一区域，则三个位点可能都在同一区域。平局规则-上颌牙弓（当两个或更多位点共享最大探诊深度且无法区分少于三个独立最深位点时）：1.6近中+2.6近中+1.1中央。此选择与Lombardo等人（2021年）使用的上颌采样位点一致，他们从右上第一磨牙和右上中切牙收集龈下样本。平局规则-下颌牙弓：4.6近中+3.6近中+4.1中央。此规则由研究者先验定义为上颌平局规则的解剖镜像（磨牙-磨牙-切牙），应用于下颌牙弓时使用对应位置的相同牙类型。未发现关于正畸患者龈下微生物群的已发表研究使用相同的下颌平局规则；因此该规则在此预先指定并记录为研究者定义的方案决策。T1和T2使用每个牙弓相同的三个指标位点。

   - 依从性监测和退出方案

   矫治器佩戴依从性（目标≥22小时/天）通过每次研究访视时的自我报告评估。报告连续两次或以上访视依从性低于22小时/天的参与者将被退出研究，其数据从符合方案分析中排除。单次访视报告不依从触发口头强化并记录为方案偏离。所有入组参与者无论依从状态均纳入意向性治疗描述。T0时：六个纸尖（每牙弓三个）全部合并至一个Eppendorf管（200微升无菌PBS）中——基线时每位参与者一管。T1和T2时：每牙弓三个纸尖合并至单独的Eppendorf管中（龈上设计牙弓和龈缘邻接设计牙弓），标记参与者代码、时间点和牙弓指定——每位参与者每个时间点两管。样本在Aorys诊所（锡比乌）2-4小时内于-20°C冷冻。样本分批运输至特古穆列什医药科学大学微生物学系，使用带冷冻凝胶包的隔热容器（运输约2-2.5小时）。分析前-20°C储存符合龈下细菌DNA保存的已验证方案。

   - 实验室分析

   样本在特古穆列什医药科学大学“George Emil Palade”微生物学系和穆列什县临床医院使用PeriodontScreen Real-TM试剂盒（Sacace Biotechnologies Srl，意大利科莫Via Scalabrini 44, 22100；REF T01707-96-S；CE认证IVD）进行分析。DNA提取：纸尖在PBS中涡旋（30秒）以洗脱细菌。悬浮液离心（12,000×g，2-3分钟），去除上清液，使用商业提取试剂盒（QIAamp DNA Mini Kit，Qiagen或等效已验证试剂盒）按制造商说明从沉淀中提取细菌DNA。实时PCR：PeriodontScreen Real-TM检测使用特异性荧光探针（FAM通道，40个循环；HEX通道内参）检测并定量七种牙周病原体物种。试剂盒验证的临床意义阈值：伴放线放线杆菌10^4拷贝/反应或以上；牙龈卟啉单胞菌、福赛坦氏菌、齿垢密螺旋体10^5或以上；牙髓卟啉单胞菌、具核梭杆菌、中间普氏菌10^6或以上。当FAM Ct小于35时，特定病原体结果为阳性。当FAM Ct小于35（无论HEX Ct值如何）或HEX Ct小于35时，结果视为有效。当FAM Ct和HEX Ct均大于35或缺失时，结果视为无效并必须重复，表明可能存在提取失败或PCR抑制。实验室人员接收编码管（参与者代码、牙弓、时间点），不知道哪个牙弓对应哪种修整线设计。此外，样本收集者（全科牙医和正畸住院医师，与治疗临床医生分离）在所有时间点完全不知道牙弓分配：收集者执行所有龈下采样，不知道每个牙弓分配了哪种修整线设计。治疗临床医生（主要研究者）保留分配密钥，仅在所有PCR分析完成后释放。

   - 统计分析

   确证性主要分析：确证性终点是T2（8周）时的牙弓水平病原体负荷评分（0-7）。单个Wilcoxon符号秩检验（配对、双侧、α=0.05）将比较T2时龈上与龈缘邻接牙弓评分。选择此检验是因为结果是在配对分口设计中的离散有序计数（整数0-7），非参数配对比较适用且不需要分布假设。T2时单个确证性检验预先指定，以控制I类错误率在α=0.05，无需多重性校正。

   - T1支持性分析：Wilcoxon符号秩检验也将在T1（4周）作为支持性、非确证性分析应用，以描述任何观察效应的时间模式。T1结果将描述性报告；不会从T1检验得出确证性推论。

   调整分析：将拟合广义估计方程（GEE）模型于T1和T2牙弓水平病原体负荷评分，具体如下：（1）响应变量：牙弓水平病原体负荷评分（0-7）；（2）连接函数：恒等；（3）分布族：高斯；（4）工作相关结构：可交换，适用于两个基线后时间点且假设受试者内跨时间相关性相等；（5）协变量：修整线设计（二分类：龈上 vs. 龈缘邻接）、时间点（分类：T1、T2）、每牙弓计划压低量（连续，毫米）。将检验设计×时间点交互项以评估修整线设计效应在T1和T2之间是否不同；如果交互项无统计学意义（p>0.10），则将其剔除并报告仅主效应模型。GEE模型考虑了时间点内的受试者内相关性，并调整了预先指定的非随机分配变量（计划压低量）。GEE分析将使用R（4.0或更高版本）中的geepack包进行。

   • 探索性分析：McNemar检验比较两种设计在T1和T2时牙弓水平红色复合体阳性（二分类结果）。仅描述性解释；不会得出确证性推论。由于牙周健康参与者中同时出现红色复合体阳性的预期患病率较低，此探索性结果的预期功效约为22%。承认此低功效，并相应将此结果登记为探索性。
   • 缺失数据：缺失结果数据将通过完整案例分析处理。T1和T2均有可评估数据的参与者将构成用于确证性分析的符合方案人群。所有入组参与者，包括T0后退出的参与者，将在意向性治疗人群中描述；鉴于预期退出率≤10%，主要分析不执行插补。
   • 软件：主要确证性分析（Wilcoxon符号秩检验）和描述性统计将使用GraphPad Prism 8（版本8.0.2）进行。GEE模型将在R（版本4.0或更高版本）中进行。所有报告的p值为双侧。未计划期中分析。
   • 样本量合理性

   样本量通过蒙特卡洛模拟（10,000次迭代）针对配对受试者内（分口）设计确定。在缺乏关于修整线设计对龈下病原体负荷影响的已发表试点数据情况下，模拟参数保守选择：

（1）牙弓间最小临床意义差异：阈值以上0.5个物种，代表龈上牙弓相比龈缘邻接牙弓多一种病原体物种跨越临床意义阈值；（2）个体牙弓水平评分的标准差（σ）：0.88，意味着配对差异的标准差（σ_D）为0.964 [σ_D = σ × sqrt(2 × (1 - ρ)) = 0.88 × sqrt(1.2) = 0.964]；这是在缺乏试点数据情况下对参与者间变异性的保守估计；配对差异模拟为近似对称（具有正态边际的高斯copula），这是Wilcoxon功效估计的保守基线；（3）受试者内相关ρ=0.4，与分口牙周微生物学研究报告值一致；（4）双侧α=0.05；（5）Wilcoxon符号秩检验。

模拟得出估计功效=82.7%（主要）和82.3%（独立验证），经验I类错误=5.0%，n=35名可评估参与者。考虑到预期退出率约10%（失访、不遵守22小时/天矫治器佩戴、方案偏离），设定入组目标为39名参与者。

- 局限性

PeriodontScreen Real-TM试剂盒在活动性牙周病人群中验证；其临床意义阈值可能未完全校准用于入组参与者的健康牙周状态。结果将相应解释。

非随机分配规则引入了牙弓水平生物力学混杂的可能性，超出计划压低量（例如，扭矩矫正、横向移动），这些未完全被GEE协变量捕获。每牙弓计划压低量记录并在GEE模型中作为连续协变量调整；无法排除来自其他移动类型的残留生物力学混杂。

由于T0样本代表合并双侧样本，无法获得牙弓特异性基线病原体评分。因此，主要分析直接比较T1和T2的牙弓特异性评分，而不调整个体牙弓水平基线值。此局限性通过纳入标准中基线临床健康牙周状态（探诊深度≤3毫米，指标位点无探诊出血）得到缓解，这最小化了干预前预先存在牙弓水平微生物学不对称的概率。