Innflytelsen av marginal avslutningsdesign for ferdigbehandlede gjennomsiktige tannstillinger på subgingival periodontalmikrobiota under ortodontisk behandling: En split-mouth-studie. (PATHO-ALIGN)

- BAKGRUNN OG RASJONALE

Klare alignere er mye brukt i ortodonti. To trimminglinjedesign er vanligvis benyttet i sluttfasen. Det supragingivale designet bruker et rett horisontalt kutt plassert omtrent 2 mm apikalt til den frie gingivalmarginen: alignerkanten dekker omtrent 2 mm av gingivavev med direkte kontakt, men trenger ikke inn i den gingivale sulkusen. Det juxtagingivale festoonerte designet bruker et bølget kutt som følger den naturlige konturen av den frie gingivalmarginen nøyaktig, og avsluttes ved gingivalmarginen uten å dekke gingivavev og uten å gå inn i sulkusen. De to designene skiller seg fundamentalt i forholdet til gingivalmarginen. Det supragingivale designet skaper et semi-inneklemt mikromiljø ved sulkusinngangen: ved å dekke 2 mm av gingivavev begrenser aligneren tilgangen til spytt og atmosfærisk oksygen til sulkusinngangsregionen. Redusert spyttklarering og redusert oksygentrykk er etablerte forhold som favoriserer anaerob bakterievekst i det periodontale miljøet. Om 2 mm gingivavevdekning av alignerkanten er tilstrekkelig til å produsere en målbær endring i sulkulært oksygentrykk eller spyttklarering er ikke direkte påvist og utgjør den biologiske hypotesen som undersøkes. Det juxtagingivale designet, som følger gingivakonturen ved marginen, lar sulkusinngangen være mer tilgjengelig for spytt og oksygen, og opprettholder potensielt mindre gunstige forhold for anaerob kolonisering. Disse mikromiljøforskjellene er ikke undersøkt i publiserte studier. Ingen tidligere studie har undersøkt om trimminglinjegeometri påvirker subgingival periodontalmikrobiotasammensetning hos pasienter som gjennomgår alignerterapi.

• STUDIEDESIGN

Dette er en prospektiv, longitudinell, innen-person (split-mouth) intervensjonsstudie. Hver deltaker mottar begge trimminglinjedesign samtidig: supragingival på en tannbue og juxtagingival festoonert på den kontralaterale buen. Split-mouth-designet kontrollerer for interindividuell variasjon i systemisk helse, munnhygiene, spyttsammensetning og basismikrobiologisk status. Alignermaterialet (CA Pro tri-lag, SCHEU-DENTAL GmbH, Iserlohn, Tyskland; CE-merket termoplast) er identisk for begge design; bare trimminglinjegeometrien er forskjellig.

• TILDELINGSREGEL (IKKE-RANDOMISERT)

Tildeling følger en forhåndsspesifisert hierarkisk regel dokumentert før inkludering:

1. Primært kriterium: Tannbuen med størst planlagt tannintrusjon (mm, fra digital behandlingsoppsett før produksjon) mottar det supragingivale designet, i samsvar med dets kliniske indikasjon for vertikal kraftoverføring.

2. Omgjøring (lik eller null planlagt intrusjon på begge buer): En forhåndsspesifisert systematisk vekslende sekvens i inkluderingsrekkefølge. Den første deltakeren som oppfyller dette kriteriet mottar supragingival på maxillarbuen; den andre på mandibularbuen; og så videre. Dette sikrer omtrent 50/50 balanse i buenivåfordeling og forhindrer buenivåforvirring. Planlagt intrusjonsstørrelse per bue registreres som en kontinuerlig kovariat i alle statistiske modeller.

   - BASISVURDERING (T0)

   Et enkelt samlet basisprøve samles inn ved å ta prøver fra tre indekssteder per bue (seks papirpunkter totalt: tre per bue), kombinert i ett Eppendorf-rør ved T0. Dette begrunnes med det grunnleggende antakelsen i split-mouth-designet: hos deltakere med klinisk sunn periodontal status ved baseline (inklusionskriterium: sonderingdybde 3 mm eller mindre, ingen BOP ved indekssteder), forventes ingen klinisk meningsfull buespesifikk mikrobiologisk forskjell før noen intervensjon. Den subgingivale mikrobiomen hos periodontalt friske individer reflekterer det felles spyttreservoaret som deles av begge buer. T0-prøven karakteriserer den overordnede basispatogenstatusen. Den primære mellom-arm-sammenligningen utføres kun ved T1 og T2, hvor buespesifikke prøver er tilgjengelige.

   - PRØVETOTALER: 175 PCR-rør (35 vurderbare deltakere x 5 rør per deltaker: 1 samlet ved T0 + 2 buespesifikke ved T1 + 2 buespesifikke ved T2). Totalt papirpunkter: 525 (35 x 15: 6 ved T0 [3 per bue x 2 buer samlet] + 3 ved T1 per bue x 2 buer + 3 ved T2 per bue x 2 buer). Enheten for PCR-analyse forblir ett resultat per bue per tidspunkt; samling av tre papirpunkter per bue øker det biologiske materialet per rør og forbedrer PCR-følsomheten uten å endre den analytiske enheten eller kraftberegningen.

   - PRØVEINNSAMLINGSPROSEDYRE

   Alle innsamlinger utføres under standardiserte fastingforhold (à jeun): deltakere avstår fra å spise, drikke (vann tillatt), pusse tenner, bruke munnskyllevann og fra å fjerne aligneren i minst 8 timer før innsamling (overnattalignerbruk). Innsamlinger finner sted om morgenen. Ved hvert besøk fjernes supragingival plakk forsiktig fra hver indekstand med en steril kurett uten å gå inn i sulkusen, og området isoleres med bomullsruller. Tre sterile papirpunkter (størrelse #25, som spesifisert av Sacace PeriodontScreen Real-TM-kittet) settes sekvensielt inn i de tre indeksstedene per bue, hvert holdt på plass i 10-20 sekunder. De tre papirpunktene fra samme bue samles umiddelbart i ett Eppendorf-rør (200 ul steril PBS), noe som gir én biologisk prøve per bue per tidspunkt.

   - INDEKSSTEDVALG (forhåndsspesifisert, registrert ved T0, uendret ved T1 og T2): Primær regel: De tre stedene med størst sonderingdybde innen hver bue velges som indekssteder, uavhengig av deres anatomiske sone (anterior, premolar eller molar). Alle tre stedene kan være i samme sone hvis disse er de dypeste. Omgjøring - Maxillarbue (når to eller flere steder deler størst sonderingdybde og færre enn tre unike dypeste steder kan skilles): mesial av tann 1.6 + mesial av tann 2.6 + sentral av tann 1.1. Dette valget er konsistent med maxillare prøvetakingssteder brukt av Lombardo et al. (2021), som samlet subgingivale prøver fra høyre øvre første molar og høyre øvre sentral incisor. Omgjøring - Mandibularbue: mesial av tann 4.6 + mesial av tann 3.6 + sentral av tann 4.1. Denne regelen er definert a priori av forskeren som den anatomiske speilbildet av maxillær omgjøring (molar-molar-incisor), brukt på mandibularbuen med de samme tamtypene i tilsvarende posisjoner. Ingen publisert studie om subgingival mikrobiota hos ortodontipasienter ble identifisert som brukte en identisk mandibular omgjøringsregel; regelen er derfor forhåndsspesifisert og dokumentert her som en forskerdefinert protokollbeslutning. De samme tre indeksstedene per bue brukes ved T1 og T2.

   - OVERTHOLDSELSEOVERVÅKING OG FRAFALLSPROTOKOLL

   Alignerbrukoppfølging (mål 22 timer/dag eller mer) vurderes ved selvrapportering ved hvert studiebesøk. Deltakere som rapporterer oppfølging under 22 timer/dag ved to eller flere påfølgende besøk trekkes fra studien, og deres data ekskluderes fra per-protokoll-analyse. Et enkelt besøk med rapportert manglende oppfølging utløser verbal forsterkning og registreres som en protokollavvik. Alle inkluderte deltakere inkluderes i en intent-to-treat-beskrivelse uavhengig av oppfølgingsstatus. Ved T0: seks papirpunkter (tre per bue) samles alle i ett Eppendorf-rør (200 ul steril PBS) - ett rør totalt per deltaker ved baseline. Ved T1 og T2: tre papirpunkter per bue samles i separate Eppendorf-rør per bue (supragingival-design bue og juxtagingival-design bue), merket med deltakernummer, tidspunkt og buebetegnelse - to rør per deltaker per tidspunkt. Rør fryses ved -20 grader C innen 2-4 timer på Aorys Clinic, Sibiu. Prøver transporteres i batcher til Institutt for Mikrobiologi, UMFST Targu Mures, i isolerte beholdere med frossen gelpakker (transport omtrent 2-2.5 timer). Lagring ved -20 grader C før analyse er konsistent med validerte protokoller for subgingival bakterie-DNA-bevaring.

   - LABORATORIEANALYSE

   Prøver analyseres ved Institutt for Mikrobiologi, George Emil Palade Universitet for Medisin, Farmaci, Vitenskap og Teknologi i Targu Mures og Mures fylkessykehus, ved bruk av PeriodontScreen Real-TM-kittet (Sacace Biotechnologies Srl, Via Scalabrini 44, 22100 Como, Italia; REF T01707-96-S; CE-merket IVD). DNA-ekstraksjon: Papirpunkter vortexes i PBS (30 sekunder) for å eluere bakterier. Suspensjon sentrifugeres (12,000 x g, 2-3 minutter), supernatant fjernes, og bakterie-DNA ekstraheres fra pelletet ved bruk av et kommersielt ekstraksjonskitt (QIAamp DNA Mini Kit, Qiagen, eller tilsvarende validert kitt) i henhold til produsentens instruksjoner. Real-time PCR: PeriodontScreen Real-TM-testen detekterer og kvantifiserer syv periodontal patogenarter ved bruk av spesifikke fluorescerende probaer (FAM-kanal, 40 sykluser; HEX-kanal internkontroll). Kitt-validerte kliniske signifikantsterskler: A. actinomycetemcomitans 10^4 kopier/reaksjon eller mer; P. gingivalis, T. forsythia, T. denticola 10^5 eller mer; P. endodontalis, F. nucleatum, P. intermedia 10^6 eller mer. Et resultat er positivt for en gitt patogen når FAM Ct er mindre enn 35. Et resultat anses som gyldig når FAM Ct er mindre enn 35 (uavhengig av HEX Ct-verdi), eller når HEX Ct er mindre enn 35. Et resultat anses som ugyldig og må gjentas når både FAM Ct og HEX Ct er større enn 35 eller fraværende, noe som indikerer mulig ekstraksjonssvikt eller PCR-hemming. Laboratoriepersonell mottar kodede rør (deltakernummer, bue, tidspunkt) uten kunnskap om hvilken bue som tilsvarer hvilket trimminglinjedesign. I tillegg er prøveinnsamleren (en generell tannlegespesialist og ortodontiresident, separat fra behandlingsklinikeren) fullstendig blindet for buetildeling på alle tidspunkter: innsamleren utfører all subgingival prøvetaking uten kunnskap om hvilket trimminglinjedesign som er tildelt hver bue. Behandlingsklinikeren (PI) beholder tildelingsnøkkelen, frigitt først etter at alle PCR-analyser er fullført.

   - STATISTISK ANALYSE

   Bekreftende primæranalyse: Det bekreftende endepunktet er buenivå patogenbyrdescore (0-7) ved T2 (8 uker). En enkelt Wilcoxon signed-rank test (parret, tosidig, alfa = 0.05) vil sammenligne supragingival versus juxtagingival buescore ved T2. Denne testen ble valgt fordi utfallsvariabelen er en diskret ordnet telling (heltall 0-7) i et parret split-mouth-design, hvor ikke-parametrisk parret sammenligning er passende og ikke krever distribusjonsantagelser. En enkelt bekreftende test ved T2 er forhåndsspesifisert for å kontrollere type I-feilraten ved alfa = 0.05 uten korreksjon for multippelitet.

   - Støtteanalyse ved T1: Wilcoxon signed-rank test vil også anvendes ved T1 (4 uker) som en støttende, ikke-bekreftende analyse for å karakterisere det temporale mønsteret av eventuelle observerte effekter. Resultater ved T1 vil rapporteres deskriptivt; ingen bekreftende slutning vil trekkes fra T1-testen.

   Justert analyse: En Generalisert Estimeringsekvasjons (GEE) modell vil tilpasses til buenivå patogenbyrdescore ved T1 og T2, med følgende spesifikasjon: (1) respons: buenivå patogenbyrdescore (0-7); (2) linkfunksjon: identitet; (3) distribusjonsfamilie: Gaussisk; (4) arbeidskorrelasjonsstruktur: utvekslingsbar, passende for to post-baseline tidspunkter med lik innen-subjekt korrelasjon antatt over tid; (5) kovariater: trimminglinjedesign (binær: supragingival vs. juxtagingival), tidspunkt (kategorisk: T1, T2), planlagt intrusjonsstørrelse per bue (kontinuerlig, mm). Design x tidspunkt interaksjonsleddet vil testes for å vurdere om effekten av trimminglinjedesign skiller seg mellom T1 og T2; hvis interaksjonsleddet ikke er statistisk signifikant (p > 0.10), vil det fjernes og en hovedeffekter-modell vil rapporteres. GEE-modellen tar hensyn til innen-subjekt korrelasjon over tidspunkter og justerer for den forhåndsspesifiserte ikke-randomiserte tildelingsvariabelen (planlagt intrusjonsstørrelse). GEE-analyser vil utføres ved bruk av geepack-pakken i R (versjon 4.0 eller senere).

   • Utforskende analyse: McNemars test som sammenligner buenivå red complex positivitet (binært utfall) mellom de to designene ved T1 og T2. Tolkes kun deskriptivt; ingen bekreftende slutning vil trekkes. Forventet kraft for dette utforskende utfallet er omtrent 22%, på grunn av den lave forventede prevalensen av samtidig red complex positivitet hos periodontalt friske deltakere. Denne lave kraften anerkjennes og utfallet registreres som utforskende tilsvarende.
   • Manglende data: Manglende utfallsdata håndteres ved komplett-sak-analyse. Deltakere med vurderbare data ved både T1 og T2 utgjør per-protokoll-populasjonen brukt i den bekreftende analysen. Alle inkluderte deltakere, inkludert de som trekker seg etter T0, vil beskrives i intent-to-treat-populasjonen; ingen imputasjon vil utføres for primæranalysen, gitt den forventede frafallsraten på 10% eller mindre.
   • Programvare: Primær bekreftende analyse (Wilcoxon signed-rank test) og deskriptiv statistikk vil utføres ved bruk av GraphPad Prism 8 (versjon 8.0.2). GEE-modeller vil utføres i R (versjon 4.0 eller senere). Alle rapporterte p-verdier er tosidige. Ingen interimanalyser er planlagt.
   • STIKKPRØVESTØRRELSEBEGRUNNELSE

   Stikkprøvestørrelse ble bestemt ved Monte Carlo-simulering (10,000 iterasjoner) for et parret innen-subjekt (split-mouth) design. Simuleringsparametere ble valgt konservativt i fravær av publiserte pilotdata spesifikt om trimminglinjedesigneffekter på subgingival patogenbyrde:

(1) minste klinisk meningsfull forskjell mellom buer: 0.5 arter over terskel, representerer én ekstra patogenart som krysser den kliniske signifikantsterskelen i den supragingivale sammenlignet med den juxtagingivale buen; (2) standardavvik for individuelle buenivåscorer (sigma): 0.88, innebærer et standardavvik for parrede forskjeller (sigma_D) på 0.964 [sigma_D = sigma x sqrt(2 x (1 - rho)) = 0.88 x sqrt(1.2) = 0.964]; dette representerer et konservativt estimat av mellom-deltaker variabilitet i fravær av pilotdata; parrede forskjeller ble simulert som omtrent symmetriske (Gaussisk kopula med normale marginaler), som er et konservativt utgangspunkt for Wilcoxon kraftestimering; (3) intra-subjekt korrelasjon rho = 0.4, konsistent med verdier rapportert for split-mouth periodontale mikrobiologiske studier; (4) tosidig alfa = 0.05; (5) Wilcoxon signed-rank test.

Simulering ga estimert kraft = 82.7% (primær) og 82.3% (uavhengig verifisering), med empirisk type I-feil = 5.0%, ved n = 35 vurderbare deltakere. For å ta hensyn til en forventet frafallsrate på omtrent 10% (tap til oppfølging, manglende oppfølging med 22 t/dag alignerbruk, protokollavvik), ble et inkluderingsmål på 39 deltakere satt.

- BEGRENSNINGER

PeriodontScreen Real-TM-kittet ble validert for populasjoner med aktiv periodontal sykdom; dets kliniske signifikantsterskler er kanskje ikke fullt kalibrert for den sunne periodontalstatusen hos inkluderte deltakere. Resultater vil tolkes tilsvarende.

Den ikke-randomiserte tildelingsregelen introduserer potensial for buenivå biomekanisk forvirring utover planlagt intrusjonsstørrelse (f.eks., dreiemomentkorreksjoner, tverrgående bevegelser), som ikke fullstendig fanges av GEE-kovariatet. Planlagt intrusjonsstørrelse per bue registreres og justeres for som en kontinuerlig kovariat i GEE-modellen; resterende biomekanisk forvirring fra andre bevegelsestyper kan ikke utelukkes.

Fordi T0-prøven representerer en samlet bilateral prøve, er buespesifikke basispatogenscore ikke tilgjengelige. Den primære analysen sammenligner derfor buespesifikke scorer ved T1 og T2 direkte, uten justering for individuelle buenivå basisverdier. Denne begrensningen dempes av inklusjonskriteriet om klinisk sunn periodontal status ved baseline (sonderingdybde 3 mm eller mindre, ingen blødning ved sondering ved indekssteder), som minimerer sannsynligheten for forhåndseksisterende buenivå mikrobiologisk asymmetri før intervensjon.