Влияние дизайна краевого завершения прозрачных элайнеров на поддесневую пародонтальную микробиоту во время ортодонтического лечения: исследование по методу split-mouth. (PATHO-ALIGN)

- ОБОСНОВАНИЕ И ЦЕЛИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Терапия с использованием прозрачных капп широко применяется в ортодонтии. В завершающей фазе лечения обычно используются два варианта дизайна линии обрезки. Супрагингивальный дизайн предполагает прямой горизонтальный срез, расположенный примерно на 2 мм апикальнее свободного края десны: край каппы покрывает примерно 2 мм ткани десны при прямом контакте, но не проникает в десневую борозду. Юкстагингивальный фестончатый дизайн использует фестончатый срез, точно повторяющий естественный контур свободного края десны и заканчивающийся на уровне десневого края, не покрывая ткань десны и не проникая в борозду. Эти два дизайна принципиально различаются по своему отношению к десневому краю. Супрагингивальный дизайн создает полузакрытую микросреду у входа в борозду: покрывая 2 мм ткани десны, каппа ограничивает доступ слюны и атмосферного кислорода к области входа в борозду. Снижение клиренса слюны и уменьшение напряжения кислорода являются установленными условиями, способствующими росту анаэробных бактерий в пародонтальной среде. Является ли покрытие краем каппы 2 мм ткани десны достаточным для создания измеримого изменения напряжения кислорода в борозде или клиренса слюны, напрямую не доказано и составляет биологическую гипотезу, исследуемую в данном исследовании. Юкстагингивальный дизайн, следуя контуру десны по её краю, оставляет вход в борозду более доступным для слюны и кислорода, потенциально поддерживая менее благоприятные условия для анаэробной колонизации. Эти различия в микросреде не исследовались в опубликованных исследованиях. Ни в одном предыдущем исследовании не изучалось, влияет ли геометрия линии обрезки на состав поддесневой пародонтальной микробиоты у пациентов, проходящих терапию каппами.

• ДИЗАЙН ИССЛЕДОВАНИЯ

Это проспективное, лонгитюдное, внутрииндивидуальное (сплит-рот) интервенционное исследование. Каждый участник получает оба варианта дизайна линии обрезки одновременно: супрагингивальный на одной зубной дуге и юкстагингивальный фестончатый на контралатеральной дуге. Сплит-рот дизайн контролирует межиндивидуальные вариации в общем состоянии здоровья, гигиене полости рта, составе слюны и исходном микробиологическом статусе. Материал каппы (CA Pro три-слой, SCHEU-DENTAL GmbH, Изерлон, Германия; термопластик с маркировкой CE) идентичен для обоих дизайнов; различается только геометрия линии обрезки.

• ПРАВИЛО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ (НЕРАНДОМИЗИРОВАННОЕ)

Распределение следует заранее установленному иерархическому правилу, задокументированному до включения в исследование:

1. Основной критерий: Зубная дуга с большей величиной планируемой интрузии зубов (мм, из цифровой настройки лечения до изготовления) получает супрагингивальный дизайн, что соответствует его клиническому показанию для передачи вертикальной силы.

2. Разрешение ничьей (равная или нулевая планируемая интрузия на обеих дугах): Заранее установленная систематическая чередующаяся последовательность в порядке включения. Первый участник, соответствующий этому критерию, получает супрагингивальный дизайн на верхней челюсти; второй — на нижней челюсти; и так далее. Это обеспечивает приблизительный баланс 50/50 в распределении на уровне дуги и предотвращает смешение на уровне дуги. Величина планируемой интрузии на дугу регистрируется как непрерывная ковариата во всех статистических моделях.

   - БАЗОВАЯ ОЦЕНКА (T0)

   Единый объединенный базовый образец собирается путем взятия проб с трех индексных участков на дугу (всего шесть бумажных штифтов: три на дугу), объединенных в одну пробирку Эппендорфа на T0. Это оправдано фундаментальным допущением сплит-рот дизайна: у участников с клинически здоровым пародонтальным статусом на исходном уровне (критерий включения: глубина зондирования 3 мм или менее, отсутствие кровоточивости при зондировании на индексных участках) до любого вмешательства не ожидается клинически значимых специфических для дуги микробиологических различий. Поддесневой микробиом пародонтально здоровых людей отражает общий резервуар слюны, общий для обеих дуг. Образец T0 характеризует общий исходный статус патогенов. Первичное сравнение между группами проводится только на T1 и T2, где доступны специфические для дуги образцы.

   - ОБЩЕЕ КОЛИЧЕСТВО ОБРАЗЦОВ: 175 пробирок для ПЦР (35 оцениваемых участников × 5 пробирок на участника: 1 объединенная на T0 + 2 специфические для дуги на T1 + 2 специфические для дуги на T2). Всего бумажных штифтов: 525 (35 × 15: 6 на T0 [3 на дугу × 2 дуги объединены] + 3 на T1 на дугу × 2 дуги + 3 на T2 на дугу × 2 дуги). Единицей анализа ПЦР остается один результат на дугу за временную точку; объединение трех бумажных штифтов на дугу увеличивает количество биологического материала на пробирку и улучшает чувствительность ПЦР без изменения аналитической единицы или расчета мощности.

   - ПРОЦЕДУРА СБОРА ОБРАЗЦОВ

   Все сборы проводятся в стандартизированных условиях натощак (à jeun): участники воздерживаются от еды, питья (вода разрешена), чистки зубов, использования ополаскивателя для рта и снятия каппы как минимум за 8 часов до сбора (ношение каппы на ночь). Сборы проводятся утром. На каждом визите супрагингивальный налет осторожно удаляется с каждого индексного зуба стерильным кюретом без проникновения в борозду, и область изолируется ватными валиками. Три стерильных бумажных штифта (размер №25, как указано в наборе Sacace PeriodontScreen Real-TM) последовательно вводятся в три индексных участка на дугу, каждый удерживается на месте в течение 10-20 секунд. Три бумажных штифта из одной дуги немедленно объединяются в одну пробирку Эппендорфа (200 мкл стерильного PBS), что дает один биологический образец на дугу за временную точку.

   - ВЫБОР ИНДЕКСНЫХ УЧАСТКОВ (заранее установленный, зарегистрированный на T0, неизменный на T1 и T2): Основное правило: Три участка с наибольшей глубиной зондирования в пределах каждой дуги выбираются в качестве индексных, независимо от их анатомической зоны (передняя, премолярная или молярная). Все три участка могут находиться в одной зоне, если они самые глубокие. Разрешение ничьей — Верхняя челюсть (когда два или более участка имеют одинаковую наибольшую глубину зондирования и можно различить менее трех уникальных самых глубоких участков): медиальная поверхность зуба 1.6 + медиальная поверхность зуба 2.6 + центральная поверхность зуба 1.1. Этот выбор соответствует участкам взятия проб на верхней челюсти, использованным Lombardo et al. (2021), которые собирали поддесневые образцы с правого верхнего первого моляра и правого верхнего центрального резца. Разрешение ничьей — Нижняя челюсть: медиальная поверхность зуба 4.6 + медиальная поверхность зуба 3.6 + центральная поверхность зуба 4.1. Это правило определено исследователем априори как анатомическое зеркало разрешения ничьей для верхней челюсти (моляр-моляр-резец), примененное к нижней челюсти с использованием тех же типов зубов в соответствующих позициях. Не было выявлено опубликованных исследований поддесневой микробиоты у ортодонтических пациентов, использовавших идентичное правило разрешения ничьей для нижней челюсти; поэтому правило заранее установлено и задокументировано здесь как решение протокола, определенное исследователем. Одни и те же три индексных участка на дугу используются на T1 и T2.

   - МОНИТОРИНГ СОБЛЮДЕНИЯ И ПРОТОКОЛ ВЫБЫВАНИЯ

   Соблюдение режима ношения капп (цель 22 часа/день или более) оценивается по самоотчету на каждом визите исследования. Участники, сообщающие о соблюдении менее 22 часов/день на двух или более последовательных визитах, исключаются из исследования, и их данные исключаются из анализа по протоколу. Единичный визит с сообщенным несоблюдением вызывает устное подкрепление и регистрируется как отклонение от протокола. Все включенные участники включаются в описание по принципу намерения лечиться независимо от статуса соблюдения. На T0: шесть бумажных штифтов (три на дугу) все объединяются в одну пробирку Эппендорфа (200 мкл стерильного PBS) — всего одна пробирка на участника на исходном уровне. На T1 и T2: три бумажных штифта на дугу объединяются в отдельные пробирки Эппендорфа на дугу (дуга с супрагингивальным дизайном и дуга с юкстагингивальным дизайном), маркированные кодом участника, временной точкой и обозначением дуги — две пробирки на участника за временную точку. Пробирки замораживаются при -20 °C в течение 2-4 часов в клинике Aorys, Сибиу. Образцы транспортируются партиями на кафедру микробиологии UMFST Тыргу-Муреш в изолированных контейнерах с замороженными гелевыми пакетами (транспортировка примерно 2-2.5 часа). Хранение при -20 °C до анализа соответствует валидированным протоколам сохранения бактериальной ДНК из поддесневых образцов.

   - ЛАБОРАТОРНЫЙ АНАЛИЗ

   Образцы анализируются на кафедре микробиологии Университета медицины, фармации, науки и технологий им. Георге Эмиля Паладе в Тыргу-Муреш и Мурешской окружной клинической больнице с использованием набора PeriodontScreen Real-TM (Sacace Biotechnologies Srl, Via Scalabrini 44, 22100 Комо, Италия; REF T01707-96-S; IVD с маркировкой CE). Экстракция ДНК: Бумажные штифты встряхиваются в PBS (30 секунд) для элюирования бактерий. Суспензия центрифугируется (12 000 × g, 2-3 минуты), супернатант удаляется, и бактериальная ДНК экстрагируется из осадка с использованием коммерческого набора для экстракции (QIAamp DNA Mini Kit, Qiagen, или эквивалентного валидированного набора) согласно инструкциям производителя. ПЦР в реальном времени: Тест PeriodontScreen Real-TM обнаруживает и количественно определяет семь видов пародонтальных патогенов с использованием специфических флуоресцентных зондов (канал FAM, 40 циклов; канал HEX внутренний контроль). Пороги клинической значимости, валидированные для набора: A. actinomycetemcomitans 10^4 копий/реакция или более; P. gingivalis, T. forsythia, T. denticola 10^5 или более; P. endodontalis, F. nucleatum, P. intermedia 10^6 или более. Результат считается положительным для данного патогена, когда Ct FAM меньше 35. Результат считается валидным, когда Ct FAM меньше 35 (независимо от значения Ct HEX), или когда Ct HEX меньше 35. Результат считается невалидным и должен быть повторен, когда и Ct FAM, и Ct HEX больше 35 или отсутствуют, что указывает на возможную неудачу экстракции или ингибирование ПЦР. Лабораторный персонал получает закодированные пробирки (код участника, дуга, временная точка) без знания того, какая дуга соответствует какому дизайну линии обрезки. Кроме того, сборщик образцов (специалист общей стоматологии и ординатор-ортодонт, отдельно от лечащего врача) полностью ослеплен в отношении распределения по дугам во все временные точки: сборщик выполняет все поддесневые взятия проб без знания того, какой дизайн линии обрезки назначен каждой дуге. Лечащий врач (PI) хранит ключ распределения, который раскрывается только после завершения всех анализов ПЦР.

   - СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

   Подтверждающий первичный анализ: Подтверждающая конечная точка — это оценка патогенной нагрузки на уровне дуги (0-7) на T2 (8 недель). Один тест Уилкоксона для связанных выборок (парный, двусторонний, альфа = 0,05) сравнит оценки дуг с супрагингивальным и юкстагингивальным дизайном на T2. Этот тест был выбран, потому что исход представляет собой дискретный порядковый счет (целые числа 0-7) в парном сплит-рот дизайне, для которого непараметрическое парное сравнение является уместным и не требует допущений о распределении. Один подтверждающий тест на T2 заранее установлен для контроля ошибки I рода на уровне альфа = 0,05 без коррекции на множественность.

   - Поддерживающий анализ на T1: Тест Уилкоксона для связанных выборок также будет применен на T1 (4 недели) в качестве поддерживающего, неподтверждающего анализа для характеристики временной картины любого наблюдаемого эффекта. Результаты на T1 будут представлены описательно; никакие подтверждающие выводы не будут сделаны из теста T1.

   Скорректированный анализ: Модель обобщенных оценочных уравнений (GEE) будет подогнана к оценкам патогенной нагрузки на уровне дуги на T1 и T2 со следующей спецификацией: (1) отклик: оценка патогенной нагрузки на уровне дуги (0-7); (2) функция связи: тождественная; (3) семейство распределений: Гауссово; (4) рабочая структура корреляции: обменная, подходящая для двух постисходных временных точек с предположением о равной внутрисубъектной корреляции во времени; (5) ковариаты: дизайн линии обрезки (бинарный: супрагингивальный vs. юкстагингивальный), временная точка (категориальная: T1, T2), величина планируемой интрузии на дугу (непрерывная, мм). Будет проверен член взаимодействия дизайн × временная точка, чтобы оценить, различается ли эффект дизайна линии обрезки между T1 и T2; если член взаимодействия не является статистически значимым (p > 0,10), он будет удален, и будет представлена модель только с основными эффектами. Модель GEE учитывает внутрисубъектную корреляцию между временными точками и корректирует заранее установленную нерандомизированную переменную распределения (величину планируемой интрузии). Анализы GEE будут выполнены с использованием пакета geepack в R (версия 4.0 или выше).

   • Исследовательский анализ: Тест Макнемара, сравнивающий позитивность по красному комплексу на уровне дуги (бинарный исход) между двумя дизайнами на T1 и T2. Интерпретируется только описательно; никакие подтверждающие выводы не будут сделаны. Ожидаемая мощность для этого исследовательского исхода составляет приблизительно 22% из-за низкой ожидаемой распространенности одновременной позитивности по красному комплексу у пародонтально здоровых участников. Эта низкая мощность признается, и исход соответственно зарегистрирован как исследовательский.
   • Пропущенные данные: Пропущенные данные по исходу будут обрабатываться анализом полных случаев. Участники с оцениваемыми данными как на T1, так и на T2 составят популяцию по протоколу, используемую в подтверждающем анализе. Все включенные участники, включая тех, кто выбыл после T0, будут описаны в популяции по принципу намерения лечиться; для первичного анализа не будет выполняться импутация, учитывая ожидаемый уровень выбывания 10% или менее.
   • Программное обеспечение: Первичный подтверждающий анализ (тест Уилкоксона) и описательная статистика будут выполнены с использованием GraphPad Prism 8 (версия 8.0.2). Модели GEE будут выполнены в R (версия 4.0 или выше). Все представленные p-значения являются двусторонними. Промежуточные анализы не планируются.
   • ОБОСНОВАНИЕ РАЗМЕРА ВЫБОРКИ

   Размер выборки был определен методом Монте-Карло (10 000 итераций) для парного внутрисубъектного (сплит-рот) дизайна. Параметры симуляции были выбраны консервативно в отсутствие опубликованных пилотных данных, специфически касающихся эффектов дизайна линии обрезки на поддесневую патогенную нагрузку:

(1) минимальная клинически значимая разница между дугами: 0,5 вида выше порога, представляющая один дополнительный вид патогена, пересекающий порог клинической значимости в супрагингивальной дуге по сравнению с юкстагингивальной; (2) стандартное отклонение индивидуальных оценок на уровне дуги (сигма): 0,88, что подразумевает стандартное отклонение парных разностей (сигма_D) 0,964 [сигма_D = сигма × sqrt(2 × (1 - ро)) = 0,88 × sqrt(1,2) = 0,964]; это представляет собой консервативную оценку межиндивидуальной вариабельности в отсутствие пилотных данных; парные разности моделировались как приблизительно симметричные (копула Гаусса с нормальными маргиналами), что является консервативным базовым допущением для оценки мощности теста Уилкоксона; (3) внутрисубъектная корреляция ро = 0,4, что соответствует значениям, сообщаемым для сплит-рот исследований пародонтальной микробиологии; (4) двусторонний альфа = 0,05; (5) тест Уилкоксона для связанных выборок.

Симуляция дала оценку мощности = 82,7% (первичная) и 82,3% (независимая проверка) с эмпирической ошибкой I рода = 5,0% при n = 35 оцениваемых участников. Чтобы учесть ожидаемый уровень выбывания приблизительно 10% (потеря для наблюдения, несоблюдение ношения каппы 22 ч/день, отклонения от протокола), была установлена цель включения 39 участников.

- ОГРАНИЧЕНИЯ

Набор PeriodontScreen Real-TM был валидирован для популяций с активным пародонтитом; его пороги клинической значимости могут быть не полностью откалиброваны для здорового пародонтального статуса включенных участников. Результаты будут интерпретироваться соответственно.

Нерандомизированное правило распределения вводит потенциал для смешения на уровне дуги по биомеханическим параметрам, выходящим за пределы величины планируемой интрузии (например, коррекции торка, трансверзальные движения), которые не полностью учитываются ковариатой GEE. Величина планируемой интрузии на дугу регистрируется и корректируется как непрерывная ковариата в модели GEE; остаточное биомеханическое смешение от других типов движений не может быть исключено.

Поскольку образец T0 представляет собой объединенный билатеральный образец, специфические для дуги исходные оценки патогенов недоступны. Поэтому первичный анализ сравнивает специфические для дуги оценки на T1 и T2 напрямую, без корректировки на индивидуальные исходные значения на уровне дуги. Это ограничение смягчается критерием включения клинически здорового пародонтального статуса на исходном уровне (глубина зондирования 3 мм или менее, отсутствие кровоточивости при зондировании на индексных участках), что минимизирует вероятность предсуществующей микробиологической асимметрии на уровне дуги до вмешательства.