Influenza della Progettazione del Termine Marginale dell'Allineatore Trasparente di Finitura sul Microbiota Periodontale Subgengivale Durante il Trattamento Ortodontico: Uno Studio a Bocca Divisa. (PATHO-ALIGN)

- BACKGROUND AND RATIONALE

La terapia con allineatori trasparenti è ampiamente utilizzata in ortodonzia. Durante la fase di finitura vengono comunemente impiegati due design di linea di rifinitura. Il design sopragengivale utilizza un taglio orizzontale dritto posizionato approssimativamente 2 mm apicalmente al margine gengivale libero: il bordo dell'allineatore copre circa 2 mm di tessuto gengivale con contatto diretto ma non penetra nel solco gengivale. Il design festonato giustagengivale utilizza un taglio sagomato che segue esattamente il contorno naturale del margine gengivale libero, terminando al margine gengivale senza coprire il tessuto gengivale e senza entrare nel solco. I due design differiscono fondamentalmente nella loro relazione con il margine gengivale. Il design sopragengivale crea un microambiente semi-chiuso all'ingresso del solco: coprendo 2 mm di tessuto gengivale, l'allineatore limita l'accesso della saliva e dell'ossigeno atmosferico alla regione dell'ingresso del solco. La ridotta clearance salivare e la diminuzione della tensione di ossigeno sono condizioni stabilite che favoriscono la crescita batterica anaerobica nell'ambiente parodontale. Se 2 mm di copertura del tessuto gengivale da parte del bordo dell'allineatore siano sufficienti per produrre un cambiamento misurabile nella tensione di ossigeno solcare o nella clearance salivare non è stato direttamente dimostrato e costituisce l'ipotesi biologica oggetto di indagine. Il design giustagengivale, seguendo il contorno gengivale al suo margine, lascia l'ingresso del solco più accessibile alla saliva e all'ossigeno, potenzialmente mantenendo condizioni meno favorevoli per la colonizzazione anaerobica. Queste differenze microambientali non sono state investigate negli studi pubblicati. Nessuno studio precedente ha esaminato se la geometria della linea di rifinitura influenzi la composizione del microbiota parodontale subgengivale in pazienti sottoposti a terapia con allineatori.

• STUDY DESIGN

Questo è uno studio interventistico prospettico, longitudinale, intrapersonale (split-mouth). Ogni partecipante riceve entrambi i design di linea di rifinitura simultaneamente: sopragengivale su un'arcata dentale e festonato giustagengivale sull'arcata controlaterale. Il design split-mouth controlla la variazione interindividuale nella salute sistemica, igiene orale, composizione salivare e stato microbiologico basale. Il materiale dell'allineatore (CA Pro tri-strato, SCHEU-DENTAL GmbH, Iserlohn, Germania; termoplastica marcata CE) è identico per entrambi i design; solo la geometria della linea di rifinitura differisce.

• ALLOCATION RULE (NON-RANDOMIZED)

L'allocazione segue una regola gerarchica pre-specificata documentata prima dell'arruolamento:

1. Criterio primario: L'arcata dentale con la maggiore magnitudine di intrusione dentale pianificata (mm, dall'impostazione digitale del trattamento prima della fabbricazione) riceve il design sopragengivale, coerente con la sua indicazione clinica per la trasmissione di forza verticale.

2. Spareggio (intrusione pianificata uguale o zero su entrambe le arcate): Una sequenza sistematica alternata pre-specificata nell'ordine di arruolamento. Il primo partecipante che soddisfa questo criterio riceve il sopragengivale sull'arcata mascellare; il secondo sull'arcata mandibolare; e così via. Ciò garantisce un bilanciamento approssimativo 50/50 nella distribuzione a livello di arcata e previene la confusione a livello di arcata. La magnitudine di intrusione pianificata per arcata è registrata come covariata continua in tutti i modelli statistici.

   - BASELINE ASSESSMENT (T0)

   Un singolo campione basale in pool è raccolto campionando tre siti indice per arcata (sei punte di carta in totale: tre per arcata), combinati in una provetta Eppendorf a T0. Ciò è giustificato dall'assunzione fondamentale del design split-mouth: in partecipanti con stato parodontale clinicamente sano al basale (criterio di inclusione: profondità di sondaggio 3 mm o meno, nessun BOP nei siti indice), non ci si aspetta alcuna differenza microbiologica clinicamente significativa specifica per arcata prima di qualsiasi intervento. Il microbioma subgengivale di individui parodontalmente sani riflette il comune serbatoio salivare condiviso da entrambe le arcate. Il campione T0 caratterizza lo stato patogeno basale complessivo. Il confronto primario tra bracci è condotto solo a T1 e T2, dove sono disponibili campioni specifici per arcata.

   - SPECIMEN TOTALS: 175 provette PCR (35 partecipanti valutabili x 5 provette per partecipante: 1 in pool a T0 + 2 specifiche per arcata a T1 + 2 specifiche per arcata a T2). Punte di carta totali: 525 (35 x 15: 6 a T0 [3 per arcata x 2 arcate in pool] + 3 a T1 per arcata x 2 arcate + 3 a T2 per arcata x 2 arcate). L'unità di analisi PCR rimane un risultato per arcata per punto temporale; il pooling di tre punte di carta per arcata aumenta il materiale biologico per provetta e migliora la sensibilità PCR senza cambiare l'unità analitica o il calcolo della potenza.

   - SAMPLE COLLECTION PROCEDURE

   Tutte le raccolte sono eseguite in condizioni di digiuno standardizzate (a digiuno): i partecipanti si astengono dal mangiare, bere (acqua permessa), spazzolare, usare collutorio e rimuovere l'allineatore per almeno 8 ore prima della raccolta (indossamento dell'allineatore notturno). Le raccolte avvengono al mattino. Ad ogni visita, la placca sopragengivale è rimossa delicatamente da ogni dente indice con una curette sterile senza entrare nel solco, e l'area è isolata con rotoli di cotone. Tre punte di carta sterili (taglia #25, come specificato dal kit Sacace PeriodontScreen Real-TM) sono inserite sequenzialmente nei tre siti indice per arcata, ciascuna tenuta in posizione per 10-20 secondi. Le tre punte di carta dalla stessa arcata sono immediatamente raccolte in una singola provetta Eppendorf (200 ul PBS sterile), producendo un campione biologico per arcata per punto temporale.

   - INDEX SITE SELECTION (pre-specificata, registrata a T0, invariata a T1 e T2): Regola primaria: I tre siti con la maggiore profondità di sondaggio all'interno di ciascuna arcata sono selezionati come siti indice, indipendentemente dalla loro zona anatomica (anteriore, premolare o molare). Tutti e tre i siti possono essere nella stessa zona se quelli sono i più profondi. Spareggio - Arcata mascellare (quando due o più siti condividono la maggiore profondità di sondaggio e meno di tre siti più profondi unici possono essere distinti): mesiale del dente 1.6 + mesiale del dente 2.6 + centrale del dente 1.1. Questa selezione è coerente con i siti di campionamento mascellari utilizzati da Lombardo et al. (2021), che hanno raccolto campioni subgengivali dal primo molare superiore destro e dall'incisivo centrale superiore destro. Spareggio - Arcata mandibolare: mesiale del dente 4.6 + mesiale del dente 3.6 + centrale del dente 4.1. Questa regola è definita a priori dall'investigatore come lo specchio anatomico dello spareggio mascellare (molare-molare-incisivo), applicato all'arcata mandibolare utilizzando gli stessi tipi di denti nelle posizioni corrispondenti. Nessuno studio pubblicato sul microbiota subgengivale in pazienti ortodontici è stato identificato che utilizzasse una regola di spareggio mandibolare identica; la regola è quindi pre-specificata e documentata qui come decisione di protocollo definita dall'investigatore. Gli stessi tre siti indice per arcata sono utilizzati a T1 e T2.

   - COMPLIANCE MONITORING AND DROPOUT PROTOCOL

   La compliance nell'indossare l'allineatore (obiettivo 22 ore/giorno o più) è valutata tramite autodichiarazione ad ogni visita di studio. I partecipanti che riportano compliance inferiore a 22 ore/giorno a due o più visite consecutive sono ritirati dallo studio e i loro dati sono esclusi dall'analisi per protocollo. Una singola visita con non-compliance dichiarata innesca un rinforzo verbale ed è registrata come deviazione dal protocollo. Tutti i partecipanti arruolati sono inclusi in una descrizione intention-to-treat indipendentemente dallo stato di compliance. A T0: sei punte di carta (tre per arcata) sono tutte raccolte in una provetta Eppendorf (200 ul PBS sterile) - una provetta totale per partecipante al basale. A T1 e T2: tre punte di carta per arcata sono raccolte in provette Eppendorf separate per arcata (arcata con design sopragengivale e arcata con design giustagengivale), etichettate con codice partecipante, punto temporale e designazione arcata - due provette per partecipante per punto temporale. Le provette sono congelate a -20 gradi C entro 2-4 ore presso la Aorys Clinic, Sibiu. I campioni sono trasportati in lotti al Dipartimento di Microbiologia, UMFST Targu Mures, in contenitori isolati con blocchi di gel congelati (trasporto approssimativamente 2-2.5 ore). Lo stoccaggio a -20 gradi C prima dell'analisi è coerente con protocolli validati per la conservazione del DNA batterico subgengivale.

   - LABORATORY ANALYSIS

   I campioni sono analizzati presso il Dipartimento di Microbiologia, Università di Medicina, Farmacia, Scienza e Tecnologia George Emil Palade di Targu Mures e l'Ospedale Clinico della Contea di Mures, utilizzando il kit PeriodontScreen Real-TM (Sacace Biotechnologies Srl, Via Scalabrini 44, 22100 Como, Italia; REF T01707-96-S; IVD marcato CE). Estrazione DNA: Le punte di carta sono vortexate in PBS (30 secondi) per eluire i batteri. La sospensione è centrifugata (12.000 x g, 2-3 minuti), il surnatante rimosso, e il DNA batterico estratto dal pellet utilizzando un kit di estrazione commerciale (QIAamp DNA Mini Kit, Qiagen, o kit equivalente validato) secondo le istruzioni del produttore. PCR in tempo reale: Il saggio PeriodontScreen Real-TM rileva e quantifica sette specie di patogeni parodontali utilizzando sonde fluorescenti specifiche (canale FAM, 40 cicli; canale HEX controllo interno). Soglie di significatività clinica validate dal kit: A. actinomycetemcomitans 10^4 copie/reazione o più; P. gingivalis, T. forsythia, T. denticola 10^5 o più; P. endodontalis, F. nucleatum, P. intermedia 10^6 o più. Un risultato è positivo per un dato patogeno quando il Ct FAM è inferiore a 35. Un risultato è considerato valido quando il Ct FAM è inferiore a 35 (indipendentemente dal valore Ct HEX), o quando il Ct HEX è inferiore a 35. Un risultato è considerato non valido e deve essere ripetuto quando sia il Ct FAM che il Ct HEX sono maggiori di 35 o assenti, indicando possibile fallimento dell'estrazione o inibizione PCR. Il personale di laboratorio riceve provette codificate (codice partecipante, arcata, punto temporale) senza conoscere quale arcata corrisponde a quale design di linea di rifinitura. Inoltre, il raccoglitore di campioni (uno specialista in odontoiatria generale e residente in ortodonzia, separato dal clinico curante) è completamente in cieco rispetto all'allocazione dell'arcata in tutti i punti temporali: il raccoglitore esegue tutto il campionamento subgengivale senza conoscere quale design di linea di rifinitura è assegnato a ciascuna arcata. Il clinico curante (PI) conserva la chiave di allocazione, rilasciata solo dopo che tutte le analisi PCR sono complete.

   - STATISTICAL ANALYSIS

   Analisi primaria confermativa: L'endpoint confermativo è il punteggio di carica patogena a livello di arcata (0-7) a T2 (8 settimane). Un singolo test di Wilcoxon signed-rank (appaiato, bilaterale, alfa = 0.05) confronterà i punteggi dell'arcata sopragengivale versus giustagengivale a T2. Questo test è stato selezionato perché l'esito è un conteggio ordinale discreto (interi 0-7) in un design split-mouth appaiato, per cui il confronto appaiato non parametrico è appropriato e non richiede assunzioni distribuzionali. Un singolo test confermativo a T2 è pre-specificato per controllare il tasso di errore di tipo I a alfa = 0.05 senza correzione per molteplicità.

   - Analisi di supporto a T1: Il test di Wilcoxon signed-rank sarà applicato anche a T1 (4 settimane) come analisi di supporto, non confermativa, per caratterizzare il pattern temporale di qualsiasi effetto osservato. I risultati a T1 saranno riportati descrittivamente; nessuna inferenza confermativa sarà tratta dal test T1.

   Analisi aggiustata: Un modello Generalized Estimating Equations (GEE) sarà adattato ai punteggi di carica patogena a livello di arcata a T1 e T2, con la seguente specificazione: (1) risposta: punteggio di carica patogena a livello di arcata (0-7); (2) funzione di collegamento: identità; (3) famiglia di distribuzione: Gaussiana; (4) struttura di correlazione di lavoro: exchangeable, appropriata per due punti temporali post-basale con correlazione intra-soggetto uguale assunta nel tempo; (5) covariate: design di linea di rifinitura (binario: sopragengivale vs. giustagengivale), punto temporale (categorico: T1, T2), magnitudine di intrusione pianificata per arcata (continua, mm). Il termine di interazione design x punto temporale sarà testato per valutare se l'effetto del design di linea di rifinitura differisce tra T1 e T2; se il termine di interazione non è statisticamente significativo (p > 0.10), sarà rimosso e sarà riportato un modello solo con effetti principali. Il modello GEE tiene conto della correlazione intra-soggetto tra i punti temporali e aggiusta per la variabile di allocazione non randomizzata pre-specificata (magnitudine di intrusione pianificata). Le analisi GEE saranno eseguite utilizzando il pacchetto geepack in R (versione 4.0 o successiva).

   • Analisi esplorativa: Test di McNemar confrontando la positività del complesso rosso a livello di arcata (esito binario) tra i due design a T1 e T2. Interpretato solo descrittivamente; nessuna inferenza confermativa sarà tratta. La potenza anticipata per questo esito esplorativo è approssimativamente 22%, a causa della bassa prevalenza attesa di positività simultanea del complesso rosso in partecipanti parodontalmente sani. Questa bassa potenza è riconosciuta e l'esito è registrato come esplorativo di conseguenza.
   • Dati mancanti: I dati di esito mancanti saranno gestiti con analisi complete-case. I partecipanti con dati valutabili sia a T1 che a T2 costituiranno la popolazione per protocollo utilizzata nell'analisi confermativa. Tutti i partecipanti arruolati, inclusi quelli che si ritirano dopo T0, saranno descritti nella popolazione intention-to-treat; nessuna imputazione sarà eseguita per l'analisi primaria, dato il tasso di dropout anticipato del 10% o meno.
   • Software: L'analisi primaria confermativa (test di Wilcoxon signed-rank) e le statistiche descrittive saranno eseguite utilizzando GraphPad Prism 8 (versione 8.0.2). I modelli GEE saranno eseguiti in R (versione 4.0 o successiva). Tutti i p-value riportati sono bilaterali. Nessuna analisi intermedia è pianificata.
   • SAMPLE SIZE JUSTIFICATION

   La dimensione del campione è stata determinata da simulazione Monte Carlo (10.000 iterazioni) per un design appaiato intra-soggetto (split-mouth). I parametri di simulazione sono stati selezionati conservativamente in assenza di dati pilota pubblicati specificamente sugli effetti del design di linea di rifinitura sulla carica patogena subgengivale:

(1) differenza clinicamente significativa minima tra arcate: 0.5 specie sopra soglia, rappresentante una specie patogena aggiuntiva che supera la soglia di significatività clinica nell'arcata sopragengivale rispetto a quella giustagengivale; (2) deviazione standard dei punteggi individuali a livello di arcata (sigma): 0.88, implicando una deviazione standard delle differenze appaiate (sigma_D) di 0.964 [sigma_D = sigma x sqrt(2 x (1 - rho)) = 0.88 x sqrt(1.2) = 0.964]; questa rappresenta una stima conservativa della variabilità tra partecipanti in assenza di dati pilota; le differenze appaiate sono state simulate come approssimativamente simmetriche (copula Gaussiana con marginali normali), che è una baseline conservativa per la stima della potenza di Wilcoxon; (3) correlazione intra-soggetto rho = 0.4, coerente con i valori riportati per studi microbiologici parodontali split-mouth; (4) alfa bilaterale = 0.05; (5) test di Wilcoxon signed-rank.

La simulazione ha prodotto una potenza stimata = 82.7% (primaria) e 82.3% (verifica indipendente), con errore di tipo I empirico = 5.0%, a n = 35 partecipanti valutabili. Per tenere conto di un tasso di dropout anticipato di circa il 10% (perdita al follow-up, non-compliance con indossamento dell'allineatore 22 h/giorno, deviazioni dal protocollo), è stato fissato un obiettivo di arruolamento di 39 partecipanti.

- LIMITATIONS

Il kit PeriodontScreen Real-TM è stato validato per popolazioni con malattia parodontale attiva; le sue soglie di significatività clinica potrebbero non essere completamente calibrate per lo stato parodontale sano dei partecipanti arruolati. I risultati saranno interpretati di conseguenza.

La regola di allocazione non randomizzata introduce potenziale per confusione biomeccanica a livello di arcata oltre la magnitudine di intrusione pianificata (es. correzioni di torque, movimenti trasversali), che non sono completamente catturati dalla covariata GEE. La magnitudine di intrusione pianificata per arcata è registrata e aggiustata come covariata continua nel modello GEE; confusione biomeccanica residua da altri tipi di movimento non può essere esclusa.

Poiché il campione T0 rappresenta un campione bilaterale in pool, i punteggi patogeni basali specifici per arcata non sono disponibili. L'analisi primaria quindi confronta direttamente i punteggi specifici per arcata a T1 e T2, senza aggiustamento per valori basali individuali a livello di arcata. Questa limitazione è mitigata dal criterio di inclusione di stato parodontale clinicamente sano al basale (profondità di sondaggio 3 mm o meno, nessun sanguinamento al sondaggio nei siti indice), che minimizza la probabilità di asimmetria microbiologica pre-esistente a livello di arcata prima dell'intervento.