Vliv návrhu okrajového ukončení dokončovacího průhledného aligneru na subgingivální periodontální mikrobiotu během ortodontické léčby: Studie s rozdělenou ústní dutinou. (PATHO-ALIGN)

- POZADÍ A ODŮVODNĚNÍ

Terapie srovnávacími dlahami je v ortodoncii široce používána. Během finální fáze se běžně používají dva návrhy linie ořezu. Návrh nad dásní používá rovný horizontální řez umístěný přibližně 2 mm apikálně od volného okraje dásně: okraj dlahy pokrývá přibližně 2 mm dásňové tkáně přímým kontaktem, ale neproniká do dásňového sulku. Návrh těsně přiléhající k dásni s festonádou používá vroubkovaný řez, který přesně kopíruje přirozený obrys volného okraje dásně, končí na úrovni dásňového okraje, aniž by pokrýval dásňovou tkáň a aniž by vstupoval do sulku. Tyto dva návrhy se zásadně liší ve svém vztahu k dásňovému okraji. Návrh nad dásní vytváří polouzavřené mikroklima u vstupu do sulku: pokrytím 2 mm dásňové tkáně dlahy omezuje přístup slin a atmosférického kyslíku do oblasti vstupu sulku. Snížený clearance slin a snížené napětí kyslíku jsou ustálené podmínky, které upřednostňují růst anaerobních bakterií v parodontálním prostředí. To, zda je pokrytí 2 mm dásňové tkáně okrajem dlahy dostatečné k vyvolání měřitelné změny v napětí kyslíku v sulku nebo v clearance slin, nebylo přímo prokázáno a představuje biologickou hypotézu, která je předmětem zkoumání. Návrh těsně přiléhající k dásni, který kopíruje obrys dásně na jejím okraji, ponechává vstup sulku přístupnější pro sliny a kyslík, potenciálně udržuje méně příznivé podmínky pro anaerobní kolonizaci. Tyto rozdíly v mikroklimatu nebyly v publikovaných studiích zkoumány. Žádná předchozí studie nezkoumala, zda geometrie linie ořezu ovlivňuje složení subgingivální parodontální mikrobioty u pacientů podstupujících terapii dlahami.

• STUDIJNÍ DESIGN

Toto je prospektivní, longitudinální, intervenční studie v rámci jedné osoby (split-mouth). Každý účastník obdrží oba návrhy linie ořezu současně: nad dásní na jednom zubním oblouku a těsně přiléhající k dásni s festonádou na kontralaterálním oblouku. Split-mouth design kontroluje mezilidskou variabilitu v systémovém zdraví, ústní hygieně, složení slin a výchozím mikrobiologickém stavu. Materiál dlahy (CA Pro tri-layer, SCHEU-DENTAL GmbH, Iserlohn, Německo; termoplast s označením CE) je pro oba návrhy identický; liší se pouze geometrie linie ořezu.

• PRAVIDLO ALOKACE (NERANDOMIZOVANÉ)

Alokace se řídí předem stanoveným hierarchickým pravidlem zdokumentovaným před zápisem:

1. Primární kritérium: Zubní oblouk s větší mírou plánované dentální intruze (mm, z digitálního léčebného plánu před výrobou) obdrží návrh nad dásní, v souladu s jeho klinickou indikací pro přenos vertikální síly.

2. Rozhodující kritérium (stejná nebo nulová plánovaná intruze na obou obloucích): Předem stanovená systematická střídající se posloupnost podle pořadí zápisu. První účastník splňující toto kritérium obdrží návrh nad dásní na maxilárním oblouku; druhý na mandibulárním oblouku; a tak dále. Tím je zajištěna přibližná 50/50 rovnováha v distribuci na úrovni oblouku a zabráněno záměně na úrovni oblouku. Míra plánované intruze na oblouk je zaznamenána jako spojitá kovariáta ve všech statistických modelech.

   - VÝCHOZÍ HODNOCENÍ (T0)

   Jediný souhrnný výchozí vzorek je odebrán odběrem ze tří indexových míst na každém oblouku (celkem šest papírových bodů: tři na oblouk), spojených do jedné Eppendorfovy zkumavky v čase T0. Toto je odůvodněno základním předpokladem split-mouth designu: u účastníků s klinicky zdravým parodontálním stavem při výchozím hodnocení (inclusní kritérium: hloubka sondování 3 mm nebo méně, žádné BOP na indexových místech) se před jakoukoli intervencí neočekává klinicky významný mikrobiologický rozdíl specifický pro oblouk. Subgingivální mikrobiom parodontálně zdravých jedinců odráží společný rezervoár slin sdílený oběma oblouky. Vzorek T0 charakterizuje celkový výchozí stav patogenů. Primární srovnání mezi rameny je provedeno pouze v časech T1 a T2, kde jsou k dispozici vzorky specifické pro oblouk.

   - CELKOVÝ POČET VZORKŮ: 175 PCR zkumavek (35 vyhodnotitelných účastníků x 5 zkumavek na účastníka: 1 souhrnná v T0 + 2 specifické pro oblouk v T1 + 2 specifické pro oblouk v T2). Celkem papírových bodů: 525 (35 x 15: 6 v T0 [3 na oblouk x 2 oblouky sloučeny] + 3 v T1 na oblouk x 2 oblouky + 3 v T2 na oblouk x 2 oblouky). Jednotkou PCR analýzy zůstává jeden výsledek na oblouk za časový bod; sloučení tří papírových bodů na oblouk zvyšuje množství biologického materiálu na zkumavku a zlepšuje citlivost PCR, aniž by se změnila analytická jednotka nebo výpočet síly testu.

   - POSTUP ODBĚRU VZORKŮ

   Všechny odběry jsou prováděny za standardizovaných podmínek nalačno (à jeun): účastníci se před odběrem alespoň 8 hodin (noční nošení dlahy) zdrží jídla, pití (voda je povolena), čištění zubů, používání ústní vody a vyjmutí dlahy. Odběry probíhají ráno. Při každé návštěvě je supragingivální plak jemně odstraněn z každého indexového zubu sterilní kyretonou bez vstupu do sulku a oblast je izolována vatovými válečky. Tři sterilní papírové body (velikost #25, jak je specifikováno v sadě Sacace PeriodontScreen Real-TM kit) jsou postupně vloženy do tří indexových míst na každém oblouku, každý je držen na místě po dobu 10-20 sekund. Tři papírové body ze stejného oblouku jsou okamžitě sloučeny do jedné Eppendorfovy zkumavky (200 ul sterilního PBS), čímž vznikne jeden biologický vzorek na oblouk za časový bod.

   - VÝBĚR INDEXOVÝCH MÍST (předem stanoven, zaznamenán v T0, nezměněn v T1 a T2): Primární pravidlo: Jako indexová místa jsou vybrána tři místa s největší hloubkou sondování v rámci každého oblouku, bez ohledu na jejich anatomickou zónu (přední zuby, premoláry nebo moláry). Všechna tři místa mohou být ve stejné zóně, pokud jsou to ta nejhlubší. Rozhodující kritérium - Maxilární oblouk (když dvě nebo více míst sdílí největší hloubku sondování a lze rozlišit méně než tři jedinečná nejhlubší místa): mezální strana zubu 1.6 + mezální strana zubu 2.6 + centrální strana zubu 1.1. Tento výběr je v souladu s maxilárními odběrovými místy použitými Lombardo et al. (2021), kteří odebírali subgingivální vzorky z pravého horního prvního moláru a pravého horního středního řezáku. Rozhodující kritérium - Mandibulární oblouk: mezální strana zubu 4.6 + mezální strana zubu 3.6 + centrální strana zubu 4.1. Toto pravidlo je předem definováno vyšetřovatelem jako anatomické zrcadlo rozhodujícího kritéria pro maxilu (molár-molár-řezák), aplikované na mandibulární oblouk s použitím stejných typů zubů v odpovídajících pozicích. Nebyla identifikována žádná publikovaná studie o subgingivální mikrobiotě u ortodontických pacientů, která by používala identické rozhodující kritérium pro mandibulu; pravidlo je proto předem stanoveno a zde dokumentováno jako rozhodnutí protokolu definované vyšetřovatelem. Stejná tři indexová místa na oblouk jsou použita v T1 a T2.

   - MONITOROVÁNÍ COMPLIANCE A PROTOKOL PRO VYŘAZENÍ

   Compliance s nošením dlahy (cíl 22 hodin/den nebo více) je hodnocena vlastním hlášením při každé studijní návštěvě. Účastníci, kteří hlásí compliance nižší než 22 hodin/den při dvou nebo více po sobě jdoucích návštěvách, jsou ze studie vyřazeni a jejich data jsou vyloučena z per-protokol analýzy. Jediná návštěva s hlášenou non-compliance spouští verbální posílení a je zaznamenána jako odchylka od protokolu. Všichni zařazení účastníci jsou zahrnuti do popisu intent-to-treat bez ohledu na stav compliance. V T0: šest papírových bodů (tři na oblouk) je vše sloučeno do jedné Eppendorfovy zkumavky (200 ul sterilního PBS) - celkem jedna zkumavka na účastníka při výchozím hodnocení. V T1 a T2: tři papírové body na oblouk jsou sloučeny do samostatných Eppendorfových zkumavek na oblouk (oblouk s návrhem nad dásní a oblouk s návrhem těsně přiléhajícím k dásni), označených kódem účastníka, časovým bodem a označením oblouku - dvě zkumavky na účastníka za časový bod. Zkumavky jsou zmraženy při -20 °C do 2-4 hodin na klinice Aorys, Sibiu. Vzorky jsou přepravovány v dávkách na Katedru mikrobiologie, UMFST Targu Mures, v izolovaných nádobách s mraženými gelovými sáčky (přeprava přibližně 2-2,5 hodiny). Skladování při -20 °C před analýzou je v souladu s validovanými protokoly pro uchování bakteriální DNA ze subgingivální oblasti.

   - LABORATORNÍ ANALÝZA

   Vzorky jsou analyzovány na Katedře mikrobiologie, Univerzity medicíny, farmacie, vědy a technologie George Emilia Paladeho v Targu Mures a v Krajské klinické nemocnici Mures, s použitím sady PeriodontScreen Real-TM kit (Sacace Biotechnologies Srl, Via Scalabrini 44, 22100 Como, Itálie; REF T01707-96-S; IVD s označením CE). Extrakce DNA: Papírové body jsou vortexovány v PBS (30 sekund) pro eluci bakterií. Suspense je centrifugována (12 000 x g, 2-3 minuty), supernatant odstraněn a bakteriální DNA extrahována z peletu pomocí komerční extrakční sady (QIAamp DNA Mini Kit, Qiagen, nebo ekvivalentní validované sady) podle instrukcí výrobce. Real-time PCR: Test PeriodontScreen Real-TM detekuje a kvantifikuje sedm druhů parodontálních patogenů pomocí specifických fluorescenčních sond (kanál FAM, 40 cyklů; interní kontrola v kanálu HEX). Klinicky významné prahové hodnoty validované v sadě: A. actinomycetemcomitans 10^4 kopií/reakce nebo více; P. gingivalis, T. forsythia, T. denticola 10^5 nebo více; P. endodontalis, F. nucleatum, P. intermedia 10^6 nebo více. Výsledek je pozitivní pro daný patogen, když je Ct FAM menší než 35. Výsledek je považován za platný, když je Ct FAM menší než 35 (bez ohledu na hodnotu Ct HEX), nebo když je Ct HEX menší než 35. Výsledek je považován za neplatný a musí být opakován, když jsou obě hodnoty Ct FAM i Ct HEX větší než 35 nebo chybí, což naznačuje možný neúspěch extrakce nebo inhibici PCR. Laboratorní personál obdrží kódované zkumavky (kód účastníka, oblouk, časový bod) bez znalosti toho, který oblouk odpovídá kterému návrhu linie ořezu. Navíc je odběratel vzorků (specialista všeobecné stomatologie a rezident ortodoncie, oddělený od ošetřujícího lékaře) vůči alokaci oblouku v každém časovém bodě zcela zaslepen: odběratel provádí veškerý subgingivální odběr bez znalosti toho, který návrh linie ořezu je přiřazen každému oblouku. Ošetřující lékař (PI) uchovává klíč alokace, který je uvolněn až po dokončení všech PCR analýz.

   - STATISTICKÁ ANALÝZA

   Potvrzující primární analýza: Potvrzujícím koncovým bodem je skóre zátěže patogenů na úrovni oblouku (0-7) v T2 (8 týdnů). Jediný Wilcoxonův test seřazených párových pozorování (párový, oboustranný, alfa = 0,05) porovná skóre oblouků nad dásní versus těsně přiléhajících k dásni v T2. Tento test byl vybrán, protože výsledkem je diskrétní ordinální počet (celá čísla 0-7) v párovém split-mouth designu, pro který je neparametrické párové srovnání vhodné a nevyžaduje předpoklady o rozdělení. Jediný potvrzující test v T2 je předem stanoven pro kontrolu chyby I. druhu na úrovni alfa = 0,05 bez korekce na multiplicitu.

   - Podpůrná analýza v T1: Wilcoxonův test seřazených párových pozorování bude také aplikován v T1 (4 týdny) jako podpůrná, nepotvrzující analýza k charakterizaci časového vzoru případného pozorovaného účinku. Výsledky v T1 budou popsány deskriptivně; z testu T1 nebude vyvozován žádný potvrzující závěr.

   Upravená analýza: Bude sestaven model zobecněných odhadových rovnic (GEE) pro skóre zátěže patogenů na úrovni oblouku v T1 a T2 s následující specifikací: (1) odpověď: skóre zátěže patogenů na úrovni oblouku (0-7); (2) spojovací funkce: identita; (3) rodina rozdělení: Gaussovské; (4) pracovní korelační struktura: zaměnitelná, vhodná pro dva časové body po výchozím hodnocení s předpokládanou stejnou korelací uvnitř subjektu v čase; (5) kovariáty: návrh linie ořezu (binární: nad dásní vs. těsně přiléhající k dásni), časový bod (kategorický: T1, T2), míra plánované intruze na oblouk (spojitá, mm). Interakční člen design x časový bod bude testován, aby se posoudilo, zda se účinek návrhu linie ořezu liší mezi T1 a T2; pokud interakční člen nebude statisticky významný (p > 0,10), bude vynechán a bude hlášen model pouze s hlavními efekty. Model GEE zohledňuje korelaci uvnitř subjektu napříč časovými body a upravuje pro předem stanovenou nerandomizovanou alokační proměnnou (míra plánované intruze). Analýzy GEE budou provedeny pomocí balíčku geepack v R (verze 4.0 nebo novější).

   • Explorativní analýza: McNemarův test porovnávající pozitivitu red komplexu na úrovni oblouku (binární výsledek) mezi dvěma návrhy v T1 a T2. Interpretován pouze deskriptivně; nebude vyvozován žádný potvrzující závěr. Očekávaná síla testu pro tento explorativní výsledek je přibližně 22 %, kvůli nízké očekávané prevalenci simultánní pozitivity red komplexu u parodontálně zdravých účastníků. Tato nízká síla testu je uznána a výsledek je proto registrován jako explorativní.
   • Chybnějící data: Chybějící výsledná data budou zpracována analýzou kompletních případů. Účastníci s vyhodnotitelnými daty v T1 i T2 budou tvořit per-protokol populaci použitou v potvrzující analýze. Všichni zařazení účastníci, včetně těch, kteří se po T0 odhlásí, budou popsáni v intent-to-treat populaci; pro primární analýzu nebude provedena žádná imputace, s ohledem na očekávanou míru vyřazení 10 % nebo méně.
   • Software: Primární potvrzující analýza (Wilcoxonův test seřazených párových pozorování) a deskriptivní statistika budou provedeny pomocí GraphPad Prism 8 (verze 8.0.2). Modely GEE budou provedeny v R (verze 4.0 nebo novější). Všechny hlášené p-hodnoty jsou oboustranné. Nejsou plánovány žádné průběžné analýzy.
   • ODŮVODNĚNÍ VELIKOSTI VZORKU

   Velikost vzorku byla určena Monte Carlo simulací (10 000 iterací) pro párový design v rámci subjektu (split-mouth). Simulační parametry byly vybrány konzervativně v nepřítomnosti publikovaných pilotních dat konkrétně o účincích návrhu linie ořezu na subgingivální zátěž patogenů:

(1) minimální klinicky významný rozdíl mezi oblouky: 0,5 druhu nad prahem, představující jeden další patogenní druh překračující klinicky významný práh v oblouku nad dásní ve srovnání s obloukem těsně přiléhajícím k dásni; (2) směrodatná odchylka jednotlivých skóre na úrovni oblouku (sigma): 0,88, což implikuje směrodatnou odchylku párových rozdílů (sigma_D) 0,964 [sigma_D = sigma x sqrt(2 x (1 - rho)) = 0,88 x sqrt(1,2) = 0,964]; to představuje konzervativní odhad variability mezi účastníky v nepřítomnosti pilotních dat; párové rozdíly byly simulovány jako přibližně symetrické (Gaussova kopula s normálními marginálami), což je konzervativní základ pro odhad síly Wilcoxonova testu; (3) intra-subjektová korelace rho = 0,4, v souladu s hodnotami hlášenými pro split-mouth parodontální mikrobiologické studie; (4) oboustranné alfa = 0,05; (5) Wilcoxonův test seřazených párových pozorování.

Simulace poskytla odhadovanou sílu testu = 82,7 % (primární) a 82,3 % (nezávislé ověření), s empirickou chybou I. druhu = 5,0 %, při n = 35 vyhodnotitelných účastníků. S ohledem na očekávanou míru vyřazení přibližně 10 % (ztráta sledování, non-compliance s nošením dlahy 22 h/den, odchylky od protokolu) byl stanoven cíl zápisu 39 účastníků.

- OMEZENÍ

Sada PeriodontScreen Real-TM kit byla validována pro populace s aktivním parodontálním onemocněním; její klinicky významné prahové hodnoty nemusí být plně kalibrovány pro zdravý parodontální stav zařazených účastníků. Výsledky budou interpretovány odpovídajícím způsobem.

Nerandomizované alokační pravidlo zavádí potenciál pro biomechanickou záměnu na úrovni oblouku nad rámec míry plánované intruze (např. korekce torze, příčné pohyby), které nejsou plně zachyceny kovariátou GEE. Míra plánované intruze na oblouk je zaznamenána a upravena jako spojitá kovariáta v modelu GEE; nelze vyloučit reziduální biomechanickou záměnu z jiných typů pohybů.

Protože vzorek T0 představuje souhrnný bilaterální vzorek, nejsou k dispozici výchozí skóre patogenů specifická pro oblouk. Primární analýza proto přímo porovnává skóre specifická pro oblouk v T1 a T2, bez úpravy za individuální výchozí hodnoty na úrovni oblouku. Toto omezení je zmírněno inklusním kritériem klinicky zdravého parodontálního stavu při výchozím hodnocení (hloubka sondování 3 mm nebo méně, žádné krvácení při sondování na indexových místech), což minimalizuje pravděpodobnost předexistující mikrobiologické asymetrie na úrovni oblouku před intervencí.