Wpływ Projektu Zakończenia Brzeżnego Przezroczystych Nakładek Ortodontycznych na Mikrobiom Poddziąsłowy w Trakcie Leczenia Ortodontycznego: Badanie Metodą Podziału Jamy Ustnej. (PATHO-ALIGN)

- TŁO I UZASADNIENIE

Terapia przezroczystymi nakładkami jest powszechnie stosowana w ortodoncji. Podczas fazy wykańczania stosuje się zwykle dwa projekty linii przycinania. Projekt naddziąsłowy wykorzystuje prosty, poziomy nacięcie umieszczone około 2 mm doogonowo od wolnego brzegu dziąsła: krawędź nakładki pokrywa około 2 mm tkanki dziąsłowej poprzez bezpośredni kontakt, ale nie wnika do kieszonki dziąsłowej. Projekt przydziąsłowy z festonowaniem wykorzystuje faliste nacięcie, które dokładnie podąża za naturalnym konturem wolnego brzegu dziąsła, kończąc się na brzegu dziąsła bez pokrywania tkanki dziąsłowej i bez wchodzenia do kieszonki. Oba projekty różnią się zasadniczo pod względem relacji z brzegiem dziąsłowym. Projekt naddziąsłowy tworzy częściowo zamknięte mikrośrodowisko przy wejściu do kieszonki: pokrywając 2 mm tkanki dziąsłowej, nakładka ogranicza dostęp śliny i tlenu atmosferycznego do obszaru wejścia do kieszonki. Zmniejszone oczyszczanie śliny i obniżone napięcie tlenu to ustalone warunki sprzyjające wzrostowi bakterii beztlenowych w środowisku przyzębia. Czy pokrycie 2 mm tkanki dziąsłowej przez krawędź nakładki jest wystarczające, aby wywołać mierzalną zmianę w napięciu tlenu w kieszonce lub oczyszczaniu śliny, nie zostało bezpośrednio wykazane i stanowi biologiczną hipotezę poddawaną badaniu. Projekt przydziąsłowy, podążając za konturem dziąsła na jego brzegu, pozostawia wejście do kieszonki bardziej dostępne dla śliny i tlenu, potencjalnie utrzymując mniej korzystne warunki dla kolonizacji beztlenowej. Te różnice mikrośrodowiskowe nie były badane w opublikowanych badaniach. Żadne wcześniejsze badanie nie sprawdzało, czy geometria linii przycinania wpływa na skład subgingiwalnej mikroflory przyzębia u pacjentów poddawanych terapii nakładkami.

• PROJEKT BADANIA

Jest to prospektywne, podłużne, wewnątrzosobnicze (split-mouth) badanie interwencyjne. Każdy uczestnik otrzymuje jednocześnie oba projekty linii przycinania: naddziąsłowy na jednym łuku zębowym i przydziąsłowy z festonowaniem na łuku przeciwstawnym. Projekt split-mouth kontroluje zmienność międzyosobniczą w zakresie zdrowia ogólnego, higieny jamy ustnej, składu śliny i wyjściowego statusu mikrobiologicznego. Materiał nakładki (CA Pro tri-layer, SCHEU-DENTAL GmbH, Iserlohn, Niemcy; termoplastyk oznakowany CE) jest identyczny dla obu projektów; różni się tylko geometria linii przycinania.

• ZASADA ALOKACJI (NIERANDOMIZOWANA)

Alokacja odbywa się zgodnie z wcześniej określoną hierarchiczną zasadą udokumentowaną przed rekrutacją:

1. Kryterium główne: Łuk zębowy z większą wielkością planowanej intruzji zębowej (mm, z cyfrowego planu leczenia przed wykonaniem) otrzymuje projekt naddziąsłowy, zgodnie z jego klinicznym wskazaniem do przenoszenia siły wertykalnej.

2. Rozstrzygnięcie remisu (równe lub zerowe planowane intruzje na obu łukach): Wcześniej określona systematyczna, naprzemienna sekwencja według kolejności rekrutacji. Pierwszy uczestnik spełniający to kryterium otrzymuje projekt naddziąsłowy na łuku szczęki; drugi na łuku żuchwy; i tak dalej. Zapewnia to przybliżoną równowagę 50/50 w dystrybucji na poziomie łuku i zapobiega zakłócaniu na poziomie łuku. Planowana wielkość intruzji na łuk jest rejestrowana jako ciągła kowariata we wszystkich modelach statystycznych.

   - OCENA WYJŚCIOWA (T0)

   Pojedyncza łączna próbka wyjściowa jest pobierana poprzez pobranie z trzech miejsc indeksowych na łuk (łącznie sześć punktów papierowych: trzy na łuk), połączonych w jedną probówkę Eppendorf w T0. Jest to uzasadnione podstawowym założeniem projektu split-mouth: u uczestników z klinicznie zdrowym stanem przyzębia na początku (kryterium włączenia: głębokość sondowania 3 mm lub mniej, brak BOP w miejscach indeksowych) nie oczekuje się klinicznie znaczącej różnicy mikrobiologicznej specyficznej dla łuku przed jakąkolwiek interwencją. Subgingiwalny mikrobiom osób ze zdrowym przyzębiem odzwierciedla wspólny rezerwuar śliny dzielony przez oba łuki. Próbka T0 charakteryzuje ogólny wyjściowy status patogenów. Podstawowe porównanie między grupami przeprowadza się tylko w T1 i T2, gdzie dostępne są próbki specyficzne dla łuku.

   - ŁĄCZNA LICZBA PRÓBEK: 175 probówek PCR (35 ocenianych uczestników x 5 probówek na uczestnika: 1 łączna w T0 + 2 specyficzne dla łuku w T1 + 2 specyficzne dla łuku w T2). Łączna liczba punktów papierowych: 525 (35 x 15: 6 w T0 [3 na łuk x 2 łuki łącznie] + 3 w T1 na łuk x 2 łuki + 3 w T2 na łuk x 2 łuki). Jednostką analizy PCR pozostaje jeden wynik na łuk na punkt czasowy; łączenie trzech punktów papierowych na łuk zwiększa materiał biologiczny na probówkę i poprawia czułość PCR bez zmiany jednostki analitycznej ani obliczeń mocy.

   - PROCEDURA POBRANIA PRÓBKI

   Wszystkie pobrania są wykonywane w ustandaryzowanych warunkach na czczo (à jeun): uczestnicy powstrzymują się od jedzenia, picia (woda dozwolona), szczotkowania, używania płynu do płukania jamy ustnej oraz od zdejmowania nakładki przez co najmniej 8 godzin przed pobraniem (nocne noszenie nakładki). Pobrania odbywają się rano. Podczas każdej wizyty płytka naddziąsłowa jest delikatnie usuwana z każdego zęba indeksowego sterylną łyżeczką bez wchodzenia do kieszonki, a obszar jest izolowany wałkami z waty. Trzy sterylne punkty papierowe (rozmiar #25, zgodnie ze specyfikacją zestawu Sacace PeriodontScreen Real-TM) są kolejno wprowadzane do trzech miejsc indeksowych na łuk, każdy utrzymywany na miejscu przez 10-20 sekund. Trzy punkty papierowe z tego samego łuku są natychmiast łączone w pojedynczej probówce Eppendorf (200 µl sterylnego PBS), dając jedną biologiczną próbkę na łuk na punkt czasowy.

   - WYBÓR MIEJSCA INDEKSOWEGO (wcześniej określony, zarejestrowany w T0, niezmieniony w T1 i T2): Zasada główna: Jako miejsca indeksowe wybiera się trzy miejsca z największą głębokością sondowania w każdym łuku, niezależnie od ich strefy anatomicznej (przednia, przedtrzonowa lub trzonowa). Wszystkie trzy miejsca mogą znajdować się w tej samej strefie, jeśli są to najgłębsze. Rozstrzygnięcie remisu - Łuk szczęki (gdy dwa lub więcej miejsc dzieli największą głębokość sondowania i można wyróżnić mniej niż trzy unikalne najgłębsze miejsca): przyśrodkowa powierzchnia zęba 1.6 + przyśrodkowa powierzchnia zęba 2.6 + środkowa powierzchnia zęba 1.1. Wybór ten jest zgodny z miejscami pobierania próbek w szczęce używanymi przez Lombardo i in. (2021), którzy pobierali próbki subgingiwalne z prawego górnego pierwszego trzonowca i prawego górnego siekacza przyśrodkowego. Rozstrzygnięcie remisu - Łuk żuchwy: przyśrodkowa powierzchnia zęba 4.6 + przyśrodkowa powierzchnia zęba 3.6 + środkowa powierzchnia zęba 4.1. Zasada ta jest zdefiniowana a priori przez badacza jako anatomiczne odbicie lustrzane rozstrzygnięcia remisu dla szczęki (trzonowiec-trzonowiec-siekacz), zastosowane do łuku żuchwy z użyciem tych samych typów zębów w odpowiednich pozycjach. Nie zidentyfikowano opublikowanego badania dotyczącego subgingiwalnej mikroflory u pacjentów ortodontycznych, które używało identycznej zasady rozstrzygnięcia remisu dla żuchwy; zasada jest więc wcześniej określona i udokumentowana tutaj jako decyzja protokołowa zdefiniowana przez badacza. Te same trzy miejsca indeksowe na łuk są używane w T1 i T2.

   - MONITOROWANIE PRZESTRZEGANIA ZASAD I PROTOKÓŁ REZYGNACJI

   Przestrzeganie noszenia nakładki (cel 22 godziny/dzień lub więcej) jest oceniane na podstawie samoopisu podczas każdej wizyty badawczej. Uczestnicy, którzy zgłaszają przestrzeganie poniżej 22 godzin/dzień podczas dwóch lub więcej kolejnych wizyt, są wykluczani z badania, a ich dane są wyłączane z analizy per-protocol. Pojedyncza wizyta ze zgłoszonym nieprzestrzeganiem wywołuje wzmocnienie werbalne i jest rejestrowana jako odchylenie od protokołu. Wszyscy zrekrutowani uczestnicy są włączeni do opisu zamiaru leczenia (intent-to-treat), niezależnie od statusu przestrzegania zasad. W T0: sześć punktów papierowych (trzy na łuk) jest wszystkich łączonych w jednej probówce Eppendorf (200 µl sterylnego PBS) - łącznie jedna probówka na uczestnika na początku. W T1 i T2: trzy punkty papierowe na łuk są łączone w oddzielnych probówkach Eppendorf na łuk (łuk z projektem naddziąsłowym i łuk z projektem przydziąsłowym), oznaczonych kodem uczestnika, punktem czasowym i oznaczeniem łuku - dwie probówki na uczestnika na punkt czasowy. Probówki są zamrażane w temperaturze -20°C w ciągu 2-4 godzin w Aorys Clinic, Sibiu. Próbki są transportowane partiami do Katedry Mikrobiologii, UMFST Targu Mures, w izolowanych pojemnikach z zamrożonymi wkładami żelowymi (transport około 2-2,5 godziny). Przechowywanie w temperaturze -20°C przed analizą jest zgodne z walidowanymi protokołami zachowania DNA bakterii subgingiwalnych.

   - ANALIZA LABORATORYJNA

   Próbki są analizowane w Katedrze Mikrobiologii, Uniwersytet Medycyny, Farmacji, Nauki i Technologii George Emil Palade w Targu Mures oraz Szpitalu Klinicznym Okręgu Mures, przy użyciu zestawu PeriodontScreen Real-TM (Sacace Biotechnologies Srl, Via Scalabrini 44, 22100 Como, Włochy; REF T01707-96-S; IVD oznakowany CE). Ekstrakcja DNA: Punkty papierowe są wirowane w PBS (30 sekund) w celu elucji bakterii. Zawiesina jest wirowana (12 000 x g, 2-3 minuty), usuwany jest supernatant, a DNA bakteryjne jest ekstrahowane z pelletu przy użyciu komercyjnego zestawu do ekstrakcji (QIAamp DNA Mini Kit, Qiagen, lub równoważnego zwalidowanego zestawu) zgodnie z instrukcjami producenta. PCR w czasie rzeczywistym: Test PeriodontScreen Real-TM wykrywa i ilościowo oznacza siedem gatunków patogenów przyzębia przy użyciu specyficznych sond fluorescencyjnych (kanał FAM, 40 cykli; kanał HEX kontrola wewnętrzna). Zwalidowane klinicznie progi istotności zestawu: A. actinomycetemcomitans 10^4 kopii/reakcja lub więcej; P. gingivalis, T. forsythia, T. denticola 10^5 lub więcej; P. endodontalis, F. nucleatum, P. intermedia 10^6 lub więcej. Wynik jest pozytywny dla danego patogenu, gdy Ct FAM jest mniejsze niż 35. Wynik jest uznawany za ważny, gdy Ct FAM jest mniejsze niż 35 (niezależnie od wartości Ct HEX), lub gdy Ct HEX jest mniejsze niż 35. Wynik jest uznawany za nieważny i musi być powtórzony, gdy zarówno Ct FAM, jak i Ct HEX są większe niż 35 lub nieobecne, co wskazuje na możliwą niepowodzenie ekstrakcji lub inhibicję PCR. Personel laboratoryjny otrzymuje zakodowane probówki (kod uczestnika, łuk, punkt czasowy) bez wiedzy, który łuk odpowiada któremu projektowi linii przycinania. Dodatkowo, osoba pobierająca próbki (specjalista stomatologii ogólnej i rezydent ortodontyczny, odrębny od klinicysty prowadzącego leczenie) jest całkowicie zaślepiona co do alokacji łuków we wszystkich punktach czasowych: pobierający wykonuje wszystkie pobrania subgingiwalne bez wiedzy, który projekt linii przycinania jest przypisany do każdego łuku. Klinicysta prowadzący leczenie (PI) przechowuje klucz alokacji, ujawniany dopiero po zakończeniu wszystkich analiz PCR.

   - ANALIZA STATYSTYCZNA

   Potwierdzająca analiza pierwotna: Punktem końcowym potwierdzającym jest wynik obciążenia patogenami na poziomie łuku (0-7) w T2 (8 tygodni). Pojedynczy test Wilcoxona dla par (parowany, dwustronny, alfa = 0,05) porówna wyniki łuków naddziąsłowych i przydziąsłowych w T2. Test ten został wybrany, ponieważ wynik jest dyskretną, porządkową liczbą (liczby całkowite 0-7) w parowanym projekcie split-mouth, dla którego nieparametryczne porównanie parowane jest odpowiednie i nie wymaga założeń dotyczących rozkładu. Pojedynczy test potwierdzający w T2 jest wcześniej określony, aby kontrolować błąd typu I na poziomie alfa = 0,05 bez korekty dla wielokrotności.

   - Analiza wspierająca w T1: Test Wilcoxona dla par zostanie również zastosowany w T1 (4 tygodnie) jako analiza wspierająca, niepotwierdzająca, aby scharakteryzować wzorzec czasowy zaobserwowanego efektu. Wyniki w T1 będą raportowane opisowo; żadne wnioski potwierdzające nie będą wyciągane z testu T1.

   Analiza skorygowana: Model Uogólnionych Równań Estymacyjnych (GEE) zostanie dopasowany do wyników obciążenia patogenami na poziomie łuku w T1 i T2, z następującą specyfikacją: (1) odpowiedź: wynik obciążenia patogenami na poziomie łuku (0-7); (2) funkcja łącza: identycznościowa; (3) rodzina rozkładów: Gaussa; (4) struktura korelacji roboczej: wymienna, odpowiednia dla dwóch punktów czasowych po wyjściowych z założoną równą korelacją wewnątrzpodmiotową w czasie; (5) kowariaty: projekt linii przycinania (binarny: naddziąsłowy vs. przydziąsłowy), punkt czasowy (kategorialny: T1, T2), planowana wielkość intruzji na łuk (ciągła, mm). Termin interakcji projekt x punkt czasowy zostanie przetestowany, aby ocenić, czy efekt projektu linii przycinania różni się między T1 a T2; jeśli termin interakcji nie jest statystycznie istotny (p > 0,10), zostanie usunięty i zostanie raportowany model tylko z efektami głównymi. Model GEE uwzględnia korelację wewnątrzpodmiotową w punktach czasowych i koryguje o wcześniej określoną zmienną alokacji nierandomizowanej (planowana wielkość intruzji). Analizy GEE będą przeprowadzane przy użyciu pakietu geepack w R (wersja 4.0 lub nowsza).

   • Analiza eksploracyjna: Test McNemara porównujący pozytywność kompleksu czerwonego na poziomie łuku (wynik binarny) między dwoma projektami w T1 i T2. Interpretowany tylko opisowo; żadne wnioski potwierdzające nie będą wyciągane. Oczekiwana moc dla tego wyniku eksploracyjnego wynosi około 22%, z powodu niskiego oczekiwanego rozpowszechnienia jednoczesnej pozytywności kompleksu czerwonego u uczestników ze zdrowym przyzębiem. Ta niska moc jest uznawana, a wynik jest odpowiednio zarejestrowany jako eksploracyjny.
   • Brakujące dane: Brakujące dane wynikowe będą obsługiwane przez analizę przypadków kompletnych. Uczestnicy z ocenianymi danymi zarówno w T1, jak i T2 będą stanowić populację per-protocol używaną w analizie potwierdzającej. Wszyscy zrekrutowani uczestnicy, włącznie z tymi, którzy zrezygnują po T0, będą opisani w populacji zamiaru leczenia (intent-to-treat); dla analizy pierwotnej nie będzie przeprowadzana imputacja, biorąc pod uwagę oczekiwaną stopę rezygnacji wynoszącą 10% lub mniej.
   • Oprogramowanie: Podstawowa analiza potwierdzająca (test Wilcoxona dla par) i statystyki opisowe będą przeprowadzane przy użyciu GraphPad Prism 8 (wersja 8.0.2). Modele GEE będą przeprowadzane w R (wersja 4.0 lub nowsza). Wszystkie raportowane wartości p są dwustronne. Nie planuje się analiz pośrednich.
   • UZASADNIENIE WIELKOŚCI PRÓBY

   Wielkość próby została określona przez symulację Monte Carlo (10 000 iteracji) dla parowanego projektu wewnątrzpodmiotowego (split-mouth). Parametry symulacji zostały wybrane konserwatywnie przy braku opublikowanych danych pilotażowych dotyczących specyficznie efektów projektu linii przycinania na obciążenie patogenami subgingiwalnymi:

(1) minimalna klinicznie znacząca różnica między łukami: 0,5 gatunku powyżej progu, reprezentująca jeden dodatkowy gatunek patogenu przekraczający klinicznie istotny próg w łuku naddziąsłowym w porównaniu z przydziąsłowym; (2) odchylenie standardowe indywidualnych wyników na poziomie łuku (sigma): 0,88, co implikuje odchylenie standardowe różnic parowanych (sigma_D) równe 0,964 [sigma_D = sigma x sqrt(2 x (1 - rho)) = 0,88 x sqrt(1,2) = 0,964]; reprezentuje to konserwatywne oszacowanie zmienności międzyosobniczej przy braku danych pilotażowych; różnice parowane były symulowane jako w przybliżeniu symetryczne (kopuła Gaussa z brzegami normalnymi), co jest konserwatywną linią bazową dla estymacji mocy testu Wilcoxona; (3) korelacja wewnątrzpodmiotowa rho = 0,4, zgodna z wartościami raportowanymi dla badań mikrobiologicznych przyzębia typu split-mouth; (4) dwustronne alfa = 0,05; (5) test Wilcoxona dla par.

Symulacja dała szacowaną moc = 82,7% (pierwotna) i 82,3% (niezależna weryfikacja), z empirycznym błędem typu I = 5,0%, przy n = 35 ocenianych uczestników. Aby uwzględnić oczekiwaną stopę rezygnacji wynoszącą około 10% (utrata do obserwacji, nieprzestrzeganie noszenia nakładki 22 h/dzień, odchylenia od protokołu), ustalono cel rekrutacyjny wynoszący 39 uczestników.

- OGRANICZENIA

Zestaw PeriodontScreen Real-TM został zwalidowany dla populacji z aktywną chorobą przyzębia; jego klinicznie istotne progi mogą nie być w pełni skalibrowane dla zdrowego stanu przyzębia zrekrutowanych uczestników. Wyniki będą interpretowane odpowiednio.

Nierandomizowana zasada alokacji wprowadza potencjał zakłócania biomechanicznego na poziomie łuku poza planowaną wielkością intruzji (np. korekty momentu obrotowego, ruchy poprzeczne), które nie są w pełni uchwycone przez kowariatę GEE. Planowana wielkość intruzji na łuk jest rejestrowana i korygowana jako ciągła kowariata w modelu GEE; resztkowe zakłócenie biomechaniczne z innych typów ruchów nie może być wykluczone.

Ponieważ próbka T0 reprezentuje łączną próbkę obustronną, wyjściowe wyniki patogenów specyficzne dla łuku nie są dostępne. Analiza pierwotna porównuje więc bezpośrednio wyniki specyficzne dla łuku w T1 i T2, bez korekty o indywidualne wartości wyjściowe na poziomie łuku. Ograniczenie to jest łagodzone przez kryterium włączenia klinicznie zdrowego stanu przyzębia na początku (głębokość sondowania 3 mm lub mniej, brak krwawienia przy sondowaniu w miejscach indeksowych), co minimalizuje prawdopodobieństwo istniejącej wcześniej asymetrii mikrobiologicznej na poziomie łuku przed interwencją.