Influência do Design da Terminação Marginal do Alinhador Transparente Final no Microbiota Periodontal Subgengival Durante o Tratamento Ortodôntico: Um Estudo de Boca Dividida. (PATHO-ALIGN)

- ENQUADRAMENTO E FUNDAMENTAÇÃO

A terapia com alinhadores transparentes é amplamente utilizada em ortodontia. Duas configurações de linha de corte são comumente empregadas durante a fase final. O design supragengival utiliza um corte horizontal reto posicionado aproximadamente 2 mm apical à margem gengival livre: a borda do alinhador cobre aproximadamente 2 mm de tecido gengival com contacto direto, mas não penetra no sulco gengival. O design festonado justagengival utiliza um corte festonado que segue exatamente o contorno natural da margem gengival livre, terminando na margem gengival sem cobrir tecido gengival e sem entrar no sulco. Os dois designs diferem fundamentalmente na sua relação com a margem gengival. O design supragengival cria um microambiente semi-fechado na entrada do sulco: ao cobrir 2 mm de tecido gengival, o alinhador limita o acesso da saliva e do oxigénio atmosférico à região da entrada do sulco. A redução da depuração salivar e a diminuição da tensão de oxigénio são condições estabelecidas que favorecem o crescimento bacteriano anaeróbico no ambiente periodontal. Se a cobertura de 2 mm de tecido gengival pela borda do alinhador é suficiente para produzir uma alteração mensurável na tensão de oxigénio do sulco ou na depuração salivar não foi demonstrado diretamente e constitui a hipótese biológica em investigação. O design justagengival, seguindo o contorno gengival na sua margem, deixa a entrada do sulco mais acessível à saliva e ao oxigénio, potencialmente mantendo condições menos favoráveis para a colonização anaeróbica. Estas diferenças microambientais não foram investigadas em estudos publicados. Nenhum estudo anterior examinou se a geometria da linha de corte afeta a composição da microbiota periodontal subgengival em pacientes submetidos a terapia com alinhadores.

• DESENHO DO ESTUDO

Este é um estudo intervencional prospetivo, longitudinal, intra-indivíduo (boca dividida). Cada participante recebe ambas as configurações de linha de corte simultaneamente: supragengival numa arcada dentária e justagengival festonado na arcada contralateral. O desenho de boca dividida controla a variação inter-indivíduo na saúde sistémica, higiene oral, composição salivar e estado microbiológico basal. O material do alinhador (CA Pro tri-camada, SCHEU-DENTAL GmbH, Iserlohn, Alemanha; termoplástico com marcação CE) é idêntico para ambos os designs; apenas a geometria da linha de corte difere.

• REGRA DE ALOCAÇÃO (NÃO RANDOMIZADA)

A alocação segue uma regra hierárquica pré-especificada documentada antes da inscrição:

1. Critério primário: A arcada dentária com maior magnitude de intrusão dentária planeada (mm, a partir do plano de tratamento digital antes da fabricação) recebe o design supragengival, consistente com a sua indicação clínica para transmissão de força vertical.

2. Critério de desempate (intrusão planeada igual ou zero em ambas as arcadas): Uma sequência sistemática alternada pré-especificada na ordem de inscrição. O primeiro participante que preencha este critério recebe supragengival na arcada maxilar; o segundo na arcada mandibular; e assim sucessivamente. Isto garante um equilíbrio aproximado de 50/50 na distribuição ao nível da arcada e previne confundimento ao nível da arcada. A magnitude de intrusão planeada por arcada é registada como uma covariável contínua em todos os modelos estatísticos.

   - AVALIAÇÃO BASAL (T0)

   Uma única amostra basal combinada é recolhida através da amostragem de três sítios índice por arcada (seis cones de papel no total: três por arcada), combinados num único tubo Eppendorf em T0. Isto é justificado pelo pressuposto fundamental do desenho de boca dividida: em participantes com estado periodontal clinicamente saudável na linha de base (critério de inclusão: profundidade de sondagem 3 mm ou menos, sem SSA [sangramento à sondagem] nos sítios índice), não é esperada nenhuma diferença microbiológica clinicamente significativa específica da arcada antes de qualquer intervenção. O microbioma subgengival de indivíduos periodontalmente saudáveis reflete o reservatório salivar comum partilhado por ambas as arcadas. A amostra T0 caracteriza o estado patogénico basal global. A comparação primária entre grupos é conduzida apenas em T1 e T2, onde estão disponíveis amostras específicas da arcada.

   - TOTAIS DE AMOSTRAS: 175 tubos de PCR (35 participantes avaliáveis x 5 tubos por participante: 1 combinado em T0 + 2 específicos da arcada em T1 + 2 específicos da arcada em T2). Total de cones de papel: 525 (35 x 15: 6 em T0 [3 por arcada x 2 arcadas combinadas] + 3 em T1 por arcada x 2 arcadas + 3 em T2 por arcada x 2 arcadas). A unidade de análise de PCR permanece um resultado por arcada por ponto temporal; a combinação de três cones de papel por arcada aumenta o material biológico por tubo e melhora a sensibilidade da PCR sem alterar a unidade analítica ou o cálculo do poder.

   - PROCEDIMENTO DE RECOLHA DE AMOSTRAS

   Todas as recolhas são realizadas em condições de jejum padronizadas (à jeun): os participantes abstêm-se de comer, beber (água permitida), escovar os dentes, usar elixir bucal e de remover o alinhador durante pelo menos 8 horas antes da recolha (uso do alinhador durante a noite). As recolhas ocorrem de manhã. Em cada visita, a placa supragengival é removida suavemente de cada dente índice com uma cureta estéril sem entrar no sulco, e a área é isolada com rolos de algodão. Três cones de papel estéreis (tamanho #25, conforme especificado pelo kit Sacace PeriodontScreen Real-TM) são inseridos sequencialmente nos três sítios índice por arcada, cada um mantido no local durante 10-20 segundos. Os três cones de papel da mesma arcada são imediatamente combinados num único tubo Eppendorf (200 ul de PBS estéril), produzindo uma amostra biológica por arcada por ponto temporal.

   - SELEÇÃO DE SÍTIOS ÍNDICE (pré-especificada, registada em T0, inalterada em T1 e T2): Regra primária: Os três sítios com maior profundidade de sondagem dentro de cada arcada são selecionados como sítios índice, independentemente da sua zona anatómica (anterior, pré-molar ou molar). Todos os três sítios podem estar na mesma zona se forem os mais profundos. Critério de desempate - Arcada maxilar (quando dois ou mais sítios partilham a maior profundidade de sondagem e menos de três sítios únicos mais profundos podem ser distinguidos): mesial do dente 1.6 + mesial do dente 2.6 + central do dente 1.1. Esta seleção é consistente com os sítios de amostragem maxilares utilizados por Lombardo et al. (2021), que recolheram amostras subgengivais do primeiro molar superior direito e do incisivo central superior direito. Critério de desempate - Arcada mandibular: mesial do dente 4.6 + mesial do dente 3.6 + central do dente 4.1. Esta regra é definida a priori pelo investigador como o espelho anatómico do critério de desempate maxilar (molar-molar-incisivo), aplicado à arcada mandibular utilizando os mesmos tipos de dentes nas posições correspondentes. Nenhum estudo publicado sobre microbiota subgengival em pacientes ortodônticos foi identificado que utilizasse uma regra de desempate mandibular idêntica; a regra é portanto pré-especificada e documentada aqui como uma decisão de protocolo definida pelo investigador. Os mesmos três sítios índice por arcada são utilizados em T1 e T2.

   - MONITORIZAÇÃO DA ADESÃO E PROTOCOLO DE DESISTÊNCIA

   A adesão ao uso do alinhador (objetivo 22 horas/dia ou mais) é avaliada por autorrelato em cada visita do estudo. Os participantes que relatam adesão abaixo de 22 horas/dia em duas ou mais visitas consecutivas são retirados do estudo e os seus dados são excluídos da análise por protocolo. Uma única visita com não adesão relatada desencadeia reforço verbal e é registada como um desvio do protocolo. Todos os participantes inscritos são incluídos numa descrição por intenção de tratar independentemente do estado de adesão. Em T0: seis cones de papel (três por arcada) são todos combinados num único tubo Eppendorf (200 ul de PBS estéril) - um tubo no total por participante na linha de base. Em T1 e T2: três cones de papel por arcada são combinados em tubos Eppendorf separados por arcada (arcada com design supragengival e arcada com design justagengival), etiquetados com o código do participante, ponto temporal e designação da arcada - dois tubos por participante por ponto temporal. Os tubos são congelados a -20 graus C dentro de 2-4 horas na Aorys Clinic, Sibiu. As amostras são transportadas em lotes para o Departamento de Microbiologia, UMFST Targu Mures, em contentores isolados com placas de gel congeladas (transporte aproximadamente 2-2.5 horas). O armazenamento a -20 graus C antes da análise é consistente com protocolos validados para preservação de DNA bacteriano subgengival.

   - ANÁLISE LABORATORIAL

   As amostras são analisadas no Departamento de Microbiologia, Universidade de Medicina, Farmácia, Ciência e Tecnologia George Emil Palade de Targu Mures e Hospital Clínico do Condado de Mures, utilizando o kit PeriodontScreen Real-TM (Sacace Biotechnologies Srl, Via Scalabrini 44, 22100 Como, Itália; REF T01707-96-S; IVD com marcação CE). Extração de DNA: Os cones de papel são agitados em vórtex em PBS (30 segundos) para eluir bactérias. A suspensão é centrifugada (12.000 x g, 2-3 minutos), o sobrenadante é removido e o DNA bacteriano é extraído do pellet usando um kit de extração comercial (QIAamp DNA Mini Kit, Qiagen, ou kit validado equivalente) de acordo com as instruções do fabricante. PCR em tempo real: O ensaio PeriodontScreen Real-TM deteta e quantifica sete espécies de patógenos periodontais utilizando sondas fluorescentes específicas (canal FAM, 40 ciclos; controlo interno canal HEX). Limiares de significância clínica validados pelo kit: A. actinomycetemcomitans 10^4 cópias/reacção ou mais; P. gingivalis, T. forsythia, T. denticola 10^5 ou mais; P. endodontalis, F. nucleatum, P. intermedia 10^6 ou mais. Um resultado é positivo para um determinado patógeno quando o Ct FAM é inferior a 35. Um resultado é considerado válido quando o Ct FAM é inferior a 35 (independentemente do valor do Ct HEX), ou quando o Ct HEX é inferior a 35. Um resultado é considerado inválido e deve ser repetido quando tanto o Ct FAM como o Ct HEX são superiores a 35 ou ausentes, indicando possível falha de extração ou inibição da PCR. O pessoal laboratorial recebe tubos codificados (código do participante, arcada, ponto temporal) sem conhecimento de qual arcada corresponde a qual design de linha de corte. Adicionalmente, o coletor de amostras (um especialista em medicina dentária geral e residente em ortodontia, separado do clínico tratante) está completamente cego para a alocação da arcada em todos os pontos temporais: o coletor realiza toda a amostragem subgengival sem conhecimento de qual design de linha de corte está atribuído a cada arcada. O clínico tratante (IP) mantém a chave de alocação, libertada apenas após a conclusão de todas as análises de PCR.

   - ANÁLISE ESTATÍSTICA

   Análise primária confirmatória: O endpoint confirmatório é o score de carga patogénica ao nível da arcada (0-7) em T2 (8 semanas). Um único teste de Wilcoxon de postos sinalizados (emparelhado, bilateral, alfa = 0.05) comparará os scores da arcada supragengival versus justagengival em T2. Este teste foi selecionado porque o resultado é uma contagem ordinal discreta (inteiros 0-7) num desenho de boca dividida emparelhado, para o qual a comparação emparelhada não paramétrica é apropriada e não requer pressupostos de distribuição. Um único teste confirmatório em T2 é pré-especificado para controlar a taxa de erro tipo I em alfa = 0.05 sem correção para multiplicidade.

   - Análise suporte em T1: O teste de Wilcoxon de postos sinalizados também será aplicado em T1 (4 semanas) como uma análise suporte, não confirmatória, para caracterizar o padrão temporal de qualquer efeito observado. Os resultados em T1 serão reportados descritivamente; nenhuma inferência confirmatória será tirada do teste T1.

   Análise ajustada: Um modelo de Equações de Estimação Generalizadas (GEE) será ajustado aos scores de carga patogénica ao nível da arcada em T1 e T2, com a seguinte especificação: (1) resposta: score de carga patogénica ao nível da arcada (0-7); (2) função de ligação: identidade; (3) família de distribuição: Gaussiana; (4) estrutura de correlação de trabalho: permutável, apropriada para dois pontos temporais pós-basais com correlação intra-sujeito igual assumida ao longo do tempo; (5) covariáveis: design de linha de corte (binário: supragengival vs. justagengival), ponto temporal (categórico: T1, T2), magnitude de intrusão planeada por arcada (contínua, mm). O termo de interação design x ponto temporal será testado para avaliar se o efeito do design de linha de corte difere entre T1 e T2; se o termo de interação não for estatisticamente significativo (p > 0.10), será removido e um modelo apenas com efeitos principais será reportado. O modelo GEE tem em conta a correlação intra-sujeito ao longo dos pontos temporais e ajusta para a variável de alocação não randomizada pré-especificada (magnitude de intrusão planeada). As análises GEE serão realizadas utilizando o pacote geepack em R (versão 4.0 ou posterior).

   • Análise exploratória: Teste de McNemar comparando a positividade do complexo vermelho ao nível da arcada (resultado binário) entre os dois designs em T1 e T2. Interpretado apenas descritivamente; nenhuma inferência confirmatória será tirada. O poder antecipado para este resultado exploratório é aproximadamente 22%, devido à baixa prevalência esperada de positividade simultânea do complexo vermelho em participantes periodontalmente saudáveis. Este baixo poder é reconhecido e o resultado é registado como exploratório em conformidade.
   • Dados em falta: Os dados de resultado em falta serão tratados por análise de casos completos. Os participantes com dados avaliáveis em T1 e T2 constituirão a população por protocolo utilizada na análise confirmatória. Todos os participantes inscritos, incluindo aqueles que desistem após T0, serão descritos na população por intenção de tratar; nenhuma imputação será realizada para a análise primária, dada a taxa de desistência antecipada de 10% ou menos.
   • Software: A análise primária confirmatória (teste de Wilcoxon de postos sinalizados) e estatísticas descritivas serão realizadas utilizando GraphPad Prism 8 (versão 8.0.2). Os modelos GEE serão realizados em R (versão 4.0 ou posterior). Todos os valores de p reportados são bilaterais. Nenhuma análise interina está planeada.
   • JUSTIFICAÇÃO DO TAMANHO AMOSTRAL

   O tamanho amostral foi determinado por simulação de Monte Carlo (10.000 iterações) para um desenho emparelhado intra-sujeito (boca dividida). Os parâmetros de simulação foram selecionados conservadoramente na ausência de dados piloto publicados especificamente sobre efeitos do design de linha de corte na carga patogénica subgengival:

(1) diferença clinicamente significativa mínima entre arcadas: 0.5 espécies acima do limiar, representando uma espécie patogénica adicional a cruzar o limiar de significância clínica na arcada supragengival comparada com a arcada justagengival; (2) desvio padrão dos scores individuais ao nível da arcada (sigma): 0.88, implicando um desvio padrão das diferenças emparelhadas (sigma_D) de 0.964 [sigma_D = sigma x sqrt(2 x (1 - rho)) = 0.88 x sqrt(1.2) = 0.964]; isto representa uma estimativa conservadora da variabilidade entre participantes na ausência de dados piloto; as diferenças emparelhadas foram simuladas como aproximadamente simétricas (cópula Gaussiana com marginais normais), que é uma linha de base conservadora para a estimativa do poder de Wilcoxon; (3) correlação intra-sujeito rho = 0.4, consistente com valores reportados para estudos microbiológicos periodontais de boca dividida; (4) alfa bilateral = 0.05; (5) teste de Wilcoxon de postos sinalizados.

A simulação produziu um poder estimado = 82.7% (primário) e 82.3% (verificação independente), com erro tipo I empírico = 5.0%, em n = 35 participantes avaliáveis. Para contabilizar uma taxa de desistência antecipada de aproximadamente 10% (perda de seguimento, não adesão ao uso do alinhador 22 h/dia, desvios do protocolo), foi definido um objetivo de inscrição de 39 participantes.

- LIMITAÇÕES

O kit PeriodontScreen Real-TM foi validado para populações com doença periodontal ativa; os seus limiares de significância clínica podem não estar totalmente calibrados para o estado periodontal saudável dos participantes inscritos. Os resultados serão interpretados em conformidade.

A regra de alocação não randomizada introduz potencial para confundimento biomecânico ao nível da arcada para além da magnitude de intrusão planeada (ex: correções de torque, movimentos transversais), que não são totalmente capturados pela covariável GEE. A magnitude de intrusão planeada por arcada é registada e ajustada como uma covariável contínua no modelo GEE; confundimento biomecânico residual de outros tipos de movimento não pode ser excluído.

Como a amostra T0 representa uma amostra bilateral combinada, scores patogénicos basais específicos da arcada não estão disponíveis. A análise primária compara portanto scores específicos da arcada em T1 e T2 diretamente, sem ajuste para valores basais individuais ao nível da arcada. Esta limitação é mitigada pelo critério de inclusão de estado periodontal clinicamente saudável na linha de base (profundidade de sondagem 3 mm ou menos, sem sangramento à sondagem nos sítios índice), o que minimiza a probabilidade de assimetria microbiológica pré-existente ao nível da arcada antes da intervenção.