Inverkan av Finishing Clear Aligner Marginal Terminationsdesign på den subgingivala parodontala mikrobiotan under ortodontisk behandling: En split-mouth-studie. (PATHO-ALIGN)

- BAKGRUND OCH MOTIV

Clear aligner-terapi används i stor utsträckning inom ortodonti. Två trimningslinje-designar används vanligtvis under avslutningsfasen. Den supragingivala designen använder ett rakt horisontellt snitt placerat ungefär 2 mm apikalt till den fria gingivalranden: alignerkanten täcker ungefär 2 mm gingivalvävnad med direktkontakt men tränger inte in i gingivalsulcus. Den juxtagingivala festongdesignen använder ett snitt med skålningsmönster som följer den fria gingivalrandens naturliga kontur exakt och avslutas vid gingivalranden utan att täcka gingivalvävnad och utan att tränga in i sulcus. De två designarna skiljer sig fundamentalt i sitt förhållande till gingivalranden. Den supragingivala designen skapar en halvsluten mikromiljö vid sulcusentrén: genom att täcka 2 mm gingivalvävnad begränsar alignern tillgången av saliv och atmosfäriskt syre till sulcusentréregionen. Reducerad salivclearance och minskat syrespänning är etablerade förhållanden som gynnar anaerob bakterietillväxt i den parodontala miljön. Om 2 mm gingivalvävnadstäckning av alignerkanten är tillräcklig för att producera en mätbar förändring i sulculärt syrespänning eller salivclearance har inte direkt påvisats och utgör den biologiska hypotes som undersöks. Den juxtagingivala designen, som följer gingivalkonturen vid dess rand, lämnar sulcusentrén mer tillgänglig för saliv och syre, vilket potentiellt upprätthåller mindre gynnsamma förhållanden för anaerob kolonisering. Dessa mikromiljöskillnader har inte undersökts i publicerade studier. Ingen tidigare studie har undersökt om trimningslinjegeometri påverkar subgingival parodontal mikrobiotasammansättning hos patienter som genomgår alignerterapi.

• STUDIEDESIGN

Detta är en prospektiv, longitudinell, inom-person (split-mouth) interventionsstudie. Varje deltagare får båda trimningslinje-designarna samtidigt: supragingival på en dental båge och juxtagingival festongdesign på den kontralaterala bågen. Split-mouth-designen kontrollerar för interindividuell variation i systemisk hälsa, munhygien, salivsammansättning och baslinjemikrobiologisk status. Alignermaterialet (CA Pro tri-layer, SCHEU-DENTAL GmbH, Iserlohn, Tyskland; CE-märkt termoplast) är identiskt för båda designarna; endast trimningslinjegeometrin skiljer sig.

• TILLDELNINGSRULELL (ICKE-RANDOMISERAD)

Tilldelning följer en förutbestämd hierarkisk regel dokumenterad före rekrytering:

1. Primärt kriterium: Den dentala bågen med större magnitud av planerad dental intrusion (mm, från den digitala behandlingsuppställningen före tillverkning) får den supragingivala designen, i enlighet med dess kliniska indikation för vertikal kraftöverföring.

2. Upplösning vid oavgjort (lika eller noll planerad intrusion på båda bågarna): En förutbestämd systematisk alternerande sekvens i rekryteringsordning. Den första deltagaren som uppfyller detta kriterium får supragingival på maxillärbågen; den andra på mandibularbågen; och så vidare. Detta säkerställer ungefärlig 50/50-balans i bågnivåfördelning och förhindrar bågnivåförvirring. Planerad intrusionsmagnitud per båge registreras som en kontinuerlig kovariat i alla statistiska modeller.

   - BASLINJEBEDÖMNING (T0)

   Ett enda sammanblandat baslinjeprov samlas in genom att provta tre indexplatser per båge (sex papperspunkter totalt: tre per båge), kombinerade i en Eppendorf-tub vid T0. Detta motiveras av split-mouth-designens grundläggande antagande: hos deltagare med kliniskt frisk parodontalstatus vid baslinjen (inklusionskriterium: sonderingdjup 3 mm eller mindre, ingen BOP vid indexplatser) förväntas ingen kliniskt meningsfull bågspecifik mikrobiologisk skillnad före någon intervention. Den subgingivala mikrobiomen hos parodontalt friska individer speglar den gemensamma salivreservoar som delas av båda bågarna. T0-provet karaktäriserar övergripande baslinjepatogenstatus. Den primära jämförelsen mellan armar utförs endast vid T1 och T2, där bågspecifika prover finns tillgängliga.

   - PROVTOTALER: 175 PCR-tuber (35 utvärderbara deltagare x 5 tuber per deltagare: 1 sammanblandad vid T0 + 2 bågspecifika vid T1 + 2 bågspecifika vid T2). Totalt antal papperspunkter: 525 (35 x 15: 6 vid T0 [3 per båge x 2 bågar sammanblandade] + 3 vid T1 per båge x 2 bågar + 3 vid T2 per båge x 2 bågar). Enheten för PCR-analys förblir ett resultat per båge per tidpunkt; sammanblandning av tre papperspunkter per båge ökar det biologiska materialet per tub och förbättrar PCR-känsligheten utan att ändra analysenheten eller powerberäkningen.

   - PROVTAGNINGSPROCEDUR

   Alla insamlingar utförs under standardiserade fastande förhållanden (à jeun): deltagare avstår från att äta, dricka (vatten tillåtet), borsta tänderna, använda munsköljmedel och från att ta bort alignern i minst 8 timmar före insamling (aligneranvändning över natten). Insamlingar sker på morgonen. Vid varje besök tas supragingival plack försiktigt bort från varje indextand med en steril kurett utan att tränga in i sulcus, och området isoleras med bomullsrullar. Tre sterila papperspunkter (storlek #25, som specificerats av Sacace PeriodontScreen Real-TM-kit) sätts sekventiellt in i de tre indexplatserna per båge, var och en hålls på plats i 10-20 sekunder. De tre papperspunkterna från samma båge sammanblandas omedelbart i en enda Eppendorf-tub (200 ul sterilt PBS), vilket ger ett biologiskt prov per båge per tidpunkt.

   - INDEXPLATSUVAL (förutbestämt, registrerat vid T0, oförändrat vid T1 och T2): Primär regel: De tre platserna med störst sonderingdjup inom varje båge väljs som indexplatser, oavsett deras anatomiska zon (anterior, premolar eller molar). Alla tre platser kan vara i samma zon om dessa är de djupaste. Upplösning vid oavgjort - Maxillärbåge (när två eller fler platser delar störst sonderingdjup och färre än tre unika djupaste platser kan urskiljas): mesialt av tand 1.6 + mesialt av tand 2.6 + centralt av tand 1.1. Detta urval överensstämmer med de maxillära provtagningsplatserna som användes av Lombardo et al. (2021), som samlade subgingivala prover från den högra övre första molar och högra övre centrala incisiv. Upplösning vid oavgjort - Mandibularbåge: mesialt av tand 4.6 + mesialt av tand 3.6 + centralt av tand 4.1. Denna regel definieras a priori av undersökaren som den anatomiska spegelbilden av den maxillära upplösningsregeln (molar-molar-incisiv), applicerad på mandibularbågen med samma tandtyper i motsvarande positioner. Ingen publicerad studie om subgingival mikrobiota hos ortodontiska patienter identifierades som använde en identisk mandibular upplösningsregel; regeln är därför förutbestämd och dokumenterad här som ett undersökardefinierat protokollbeslut. Samma tre indexplatser per båge används vid T1 och T2.

   - COMPLIANCE-ÖVERVAKNING OCH AVHOPPNINGSPROTOKOLL

   Alignernedbärande-compliance (mål 22 timmar/dag eller mer) bedöms genom självrapportering vid varje studiebesök. Deltagare som rapporterar compliance under 22 timmar/dag vid två eller fler på varandra följande besök dras tillbaka från studien och deras data exkluderas från per-protokoll-analys. Ett enda besök med rapporterad icke-compliance utlöser muntlig förstärkning och registreras som en protokollavvikelse. Alla rekryterade deltagare ingår i en intent-to-treat-beskrivning oavsett compliancestatus. Vid T0: sex papperspunkter (tre per båge) sammanblandas alla i en Eppendorf-tub (200 ul sterilt PBS) - en tub totalt per deltagare vid baslinjen. Vid T1 och T2: tre papperspunkter per båge sammanblandas i separata Eppendorf-tuber per båge (supragingival-designbåge och juxtagingival-designbåge), märkta med deltagarkod, tidpunkt och bågbeteckning - två tuber per deltagare per tidpunkt. Tuber frysas vid -20 grader C inom 2-4 timmar på Aorys Clinic, Sibiu. Prover transporteras i satser till Institutionen för Mikrobiologi, UMFST Targu Mures, i isolerade behållare med frysta gelpack (transport ungefär 2-2.5 timmar). Lagring vid -20 grader C före analys överensstämmer med validerade protokoll för subgingival bakterie-DNA-bevarande.

   - LABORATORIEANALYS

   Prover analyseras vid Institutionen för Mikrobiologi, George Emil Palade University of Medicine, Pharmacy, Science, and Technology of Targu Mures och Mures County Clinical Hospital, med hjälp av PeriodontScreen Real-TM-kit (Sacace Biotechnologies Srl, Via Scalabrini 44, 22100 Como, Italien; REF T01707-96-S; CE-märkt IVD). DNA-extraktion: Papperspunkter vortexas i PBS (30 sekunder) för att eluera bakterier. Suspensionen centrifugeras (12,000 x g, 2-3 minuter), supernatant tas bort, och bakterie-DNA extraheras från pelleten med ett kommersiellt extraktionskit (QIAamp DNA Mini Kit, Qiagen, eller likvärdigt validerat kit) enligt tillverkarens instruktioner. Real-time PCR: PeriodontScreen Real-TM-analysen detekterar och kvantifierar sju parodontala patogenarter med specifika fluorescerande prober (FAM-kanal, 40 cykler; HEX-kanal intern kontroll). Kit-validerade kliniska signifikantströsklar: A. actinomycetemcomitans 10^4 kopior/reaktion eller mer; P. gingivalis, T. forsythia, T. denticola 10^5 eller mer; P. endodontalis, F. nucleatum, P. intermedia 10^6 eller mer. Ett resultat är positivt för en given patogen när FAM Ct är mindre än 35. Ett resultat anses giltigt när FAM Ct är mindre än 35 (oberoende av HEX Ct-värde), eller när HEX Ct är mindre än 35. Ett resultat anses ogiltigt och måste upprepas när både FAM Ct och HEX Ct är större än 35 eller frånvarande, vilket indikerar möjlig extraktionsmisslyckande eller PCR-hämning. Laboratoriepersonal tar emot kodade tuber (deltagarkod, båge, tidpunkt) utan kunskap om vilken båge som motsvarar vilken trimningslinje-design. Dessutom är provtagaren (en allmäntandläkare och ortodontisk specialistutbildning, separat från behandlande kliniker) helt blindad för bågtilldelning vid alla tidpunkter: provtagaren utför all subgingival provtagning utan kunskap om vilken trimningslinje-design som är tilldelad varje båge. Den behandlande klinikern (PI) behåller tilldelningsnyckeln, släppt först efter att alla PCR-analyser är klara.

   - STATISTISK ANALYS

   Bekräftande primäranalys: Det bekräftande slutpunkten är bågnivåpatogenbördan-poäng (0-7) vid T2 (8 veckor). Ett enda Wilcoxon signed-rank test (parat, tvåsidigt, alfa = 0.05) kommer att jämföra supragingivala versus juxtagingivala bågpoäng vid T2. Detta test valdes eftersom utfallsvariabeln är en diskret ordinar räkning (heltal 0-7) i en parad split-mouth-design, för vilken icke-parametrisk parad jämförelse är lämplig och inte kräver distributionsantaganden. Ett enda bekräftande test vid T2 är förutbestämt för att kontrollera typ I-felfrekvensen vid alfa = 0.05 utan korrigering för multiplikitet.

   - Stödjande analys vid T1: Wilcoxon signed-rank test kommer också att tillämpas vid T1 (4 veckor) som en stödjande, icke-bekräftande analys för att karaktärisera det temporala mönstret av eventuell observerad effekt. Resultat vid T1 kommer att rapporteras deskriptivt; ingen bekräftande slutsats kommer att dras från T1-testet.

   Justerad analys: En Generalized Estimating Equations (GEE)-modell kommer att anpassas till bågnivåpatogenbördan-poäng vid T1 och T2, med följande specifikation: (1) respons: bågnivåpatogenbördan-poäng (0-7); (2) länkfunktion: identitet; (3) distributionsfamilj: Gaussian; (4) arbetskorrelationsstruktur: utbytbar, lämplig för två post-baslinjetidpunkter med lika inom-subjektkorrelation antagen över tid; (5) kovariater: trimningslinje-design (binär: supragingival vs. juxtagingival), tidpunkt (kategorisk: T1, T2), planerad intrusionsmagnitud per båge (kontinuerlig, mm). Design x tidpunkt interaktionsterm kommer att testas för att bedöma om effekten av trimningslinje-design skiljer sig mellan T1 och T2; om interaktionstermen inte är statistiskt signifikant (p > 0.10), kommer den att tas bort och en modell med endast huvudeffekter kommer att rapporteras. GEE-modellen tar hänsyn till inom-subjektkorrelation över tidpunkter och justerar för den förutbestämda icke-slumpmässiga tilldelningsvariabeln (planerad intrusionsmagnitud). GEE-analyser kommer att utföras med hjälp av geepack-paketet i R (version 4.0 eller senare).

   • Explorativ analys: McNemars test som jämför bågnivå red complex-positivitet (binärt utfall) mellan de två designarna vid T1 och T2. Tolkas endast deskriptivt; ingen bekräftande slutsats kommer att dras. Förväntad power för detta explorativa utfall är ungefär 22%, på grund av den låga förväntade prevalensen av simultan red complex-positivitet hos parodontalt friska deltagare. Denna låga power erkänns och utfallsvariabeln registreras som explorativ i enlighet med detta.
   • Saknade data: Saknade utfallsdata hanteras genom komplett-fall-analys. Deltagare med utvärderbara data vid både T1 och T2 kommer att utgöra per-protokoll-populationen som används i den bekräftande analysen. Alla rekryterade deltagare, inklusive de som hoppar av efter T0, kommer att beskrivas i intent-to-treat-populationen; ingen imputering kommer att utföras för primäranalysen, med tanke på den förväntade avhoppsfrekvensen på 10% eller mindre.
   • Mjukvara: Primär bekräftande analys (Wilcoxon signed-rank test) och deskriptiv statistik kommer att utföras med GraphPad Prism 8 (version 8.0.2). GEE-modeller kommer att utföras i R (version 4.0 eller senare). Alla rapporterade p-värden är tvåsidiga. Inga interimanalyser är planerade.
   • STICKPROVSSTORLEKSMOTIVERING

   Stickprovsstorlek bestämdes genom Monte Carlo-simulering (10,000 iterationer) för en parad inom-subjekt (split-mouth)-design. Simuleringsparametrar valdes konservativt i avsaknad av publicerade pilotdata specifikt om trimningslinje-designeffekter på subgingival patogenbörda:

(1) minsta kliniskt meningsfulla skillnad mellan bågar: 0.5 arter över tröskel, representerar en extra patogenart som korsar den kliniska signifikantströskeln i den supragingivala jämfört med den juxtagingivala bågen; (2) standardavvikelse för individuella bågnivåpoäng (sigma): 0.88, vilket innebär en standardavvikelse av parade skillnader (sigma_D) på 0.964 [sigma_D = sigma x sqrt(2 x (1 - rho)) = 0.88 x sqrt(1.2) = 0.964]; detta representerar en konservativ uppskattning av mellan-deltagarvariabilitet i avsaknad av pilotdata; parade skillnader simulerades som ungefär symmetriska (Gaussian copula med normala marginaler), vilket är en konservativ baslinje för Wilcoxon power-uppskattning; (3) intra-subjektkorrelation rho = 0.4, i enlighet med värden rapporterade för split-mouth parodontal mikrobiologiska studier; (4) tvåsidig alfa = 0.05; (5) Wilcoxon signed-rank test.

Simulering gav uppskattad power = 82.7% (primär) och 82.3% (oberoende verifiering), med empirisk typ I-fel = 5.0%, vid n = 35 utvärderbara deltagare. För att ta hänsyn till en förväntad avhoppsfrekvens på ungefär 10% (bortfall från uppföljning, icke-compliance med 22 h/dag alignernedbärande, protokollavvikelser), sattes ett rekryteringsmål på 39 deltagare.

- BEGRÄNSNINGAR

PeriodontScreen Real-TM-kit validerades för populationer med aktiv parodontal sjukdom; dess kliniska signifikantströsklar kanske inte är fullt kalibrerade för den friska parodontalstatusen hos rekryterade deltagare. Resultat kommer att tolkas i enlighet med detta.

Den icke-slumpmässiga tilldelningsregeln introducerar potential för bågnivåbiomekanisk förvirring bortom planerad intrusionsmagnitud (t.ex. vridningskorrigeringar, transversella rörelser), vilka inte fullt ut fångas av GEE-kovariaten. Planerad intrusionsmagnitud per båge registreras och justeras för som en kontinuerlig kovariat i GEE-modellen; residual biomekanisk förvirring från andra rörelseformer kan inte uteslutas.

Eftersom T0-provet representerar ett sammanblandat bilateralt prov, finns inte bågspecifika baslinjepatogenpoäng tillgängliga. Den primära analysen jämför därför bågspecifika poäng vid T1 och T2 direkt, utan justering för individuella bågnivåbaslinjevärden. Denna begränsning mildras av inklusionskriteriet av kliniskt frisk parodontalstatus vid baslinjen (sonderingdjup 3 mm eller mindre, ingen blödning vid sondering vid indexplatser), vilket minimerar sannolikheten för förhandenvarande bågnivåmikrobiologisk asymmetri före intervention.