교정 치료 중 치은연하 치주 미생물 군집에 대한 피니싱 클리어 얼라이나의 변연 종결 디자인의 영향: 분할구 연구 (PATHO-ALIGN)

- 배경 및 근거

투명 교정장치 치료는 교정학에서 널리 사용됩니다.
마무리 단계에서 일반적으로 두 가지 트리밍 라인 설계가 사용됩니다.
치은상 설계는 자유 치은연으로부터 약 2mm 근심에 위치한 직선 수평 절단을 사용합니다: 교정장치 가장자리는 약 2mm의 치은 조직을 직접 접촉하여 덮지만 치은열구로 침투하지는 않습니다.
치은연 접촉형 페스툰 설계는 자유 치은연의 자연스러운 윤곽을 정확히 따라가는 물결 모양 절단을 사용하며, 치은 조직을 덮지 않고 열구로 들어가지 않으면서 치은연에서 끝납니다.
두 설계는 치은연과의 관계에서 근본적으로 다릅니다.
치은상 설계는 열구 입구에 반폐쇄적 미세환경을 생성합니다: 2mm의 치은 조직을 덮음으로써 교정장치는 타액과 대기 중 산소가 열구 입구 영역에 접근하는 것을 제한합니다.
감소된 타액 청소와 낮아진 산소 분압은 치주 환경에서 혐기성 세균 성장을 촉진하는 확립된 조건입니다.
교정장치 가장자리에 의한 2mm 치은 조직 덮개가 열구 산소 분압이나 타액 청소에서 측정 가능한 변화를 일으킬 만큼 충분한지 여부는 직접적으로 입증된 바 없으며, 이는 조사 중인 생물학적 가설을 구성합니다.
치은연 접촉형 설계는 그 가장자리에서 치은 윤곽을 따라가며, 열구 입구를 타액과 산소에 더 접근 가능하게 남겨두어 혐기성 정착에 덜 유리한 조건을 유지할 가능성이 있습니다.
이러한 미세환경적 차이는 발표된 연구에서 조사된 바 없습니다.
교정장치 치료를 받는 환자에서 트리밍 라인 기하학이 치은하 치주 미생물 군집 구성에 영향을 미치는지 여부를 조사한 선행 연구는 없습니다.

• 연구 설계

이는 전향적, 종단적, 개인 내(분할구) 중재 연구입니다.
각 참가자는 두 가지 트리밍 라인 설계를 동시에 받습니다: 한 치열궁에는 치은상 설계, 반대측 치열궁에는 치은연 접촉형 페스툰 설계를 적용합니다.
분할구 설계는 전신 건강, 구강 위생, 타액 구성 및 기초 미생물학적 상태에서의 개인 간 변이를 통제합니다.
교정장치 재료(CA Pro 삼중층, SCHEU-DENTAL GmbH, Iserlohn, Germany; CE 표시 열가소성)는 두 설계 모두 동일합니다; 트리밍 라인 기하학만 다릅니다.

• 할당 규칙(비무작위)

할당은 등록 전에 문서화된 사전 지정된 계층적 규칙을 따릅니다:

1. 1차 기준: 계획된 치아 함입 정도가 더 큰 치열궁(mm, 제작 전 디지털 치료 설정에서)이 치은상 설계를 받으며, 이는 수직력 전달에 대한 임상적 적응증과 일치합니다.

2. 동점 처리(양측 치열궁에서 계획된 함입이 동일하거나 0인 경우): 등록 순서에 따른 사전 지정된 체계적 교대 순서.
   이 기준을 충족하는 첫 번째 참가자는 상악궁에 치은상 설계를 받습니다; 두 번째는 하악궁에 받습니다; 이를 반복합니다.
   이는 치열궁 수준 분포에서 대략 50/50 균형을 보장하고 치열궁 수준 교란을 방지합니다.
   치열궁당 계획된 함입 정도는 모든 통계 모델에서 연속 공변량으로 기록됩니다.

   - 기초 평가(T0)

   단일 풀링된 기초 표본은 치열궁당 세 개의 지표 부위(총 여섯 개의 페이퍼 포인트: 치열궁당 세 개)를 채취하여 T0에서 하나의 Eppendorf 튜브로 결합하여 수집됩니다.
   이는 분할구 설계의 근본적 가정에 의해 정당화됩니다: 기초 시 임상적으로 건강한 치주 상태(포함 기준: 탐침 깊이 3mm 이하, 지표 부위에서 BOP 없음)를 가진 참가자에서는 중재 전에 임상적으로 의미 있는 치열궁 특이적 미생물학적 차이가 예상되지 않습니다.
   치주 건강한 개인의 치은하 미생물군은 양측 치열궁이 공유하는 공통 타액 저장소를 반영합니다.
   T0 표본은 전체 기초 병원체 상태를 특성화합니다.
   주요 군 간 비교는 T1과 T2에서만 수행되며, 여기서 치열궁 특이적 표본이 이용 가능합니다.

   - 표본 총계: 175개 PCR 튜브(35명 평가 가능 참가자 x 참가자당 5개 튜브: T0에서 1개 풀링 + T1에서 치열궁당 2개 + T2에서 치열궁당 2개).
   총 페이퍼 포인트: 525개(35 x 15: T0에서 6개[치열궁당 3개 x 2개 치열궁 풀링] + T1에서 치열궁당 3개 x 2개 치열궁 + T2에서 치열궁당 3개 x 2개 치열궁).
   PCR 분석 단위는 여전히 시간 지점별 치열궁당 하나의 결과입니다; 치열궁당 세 개의 페이퍼 포인트 풀링은 튜브당 생물학적 물질을 증가시키고 분석 단위나 검정력 계산을 변경하지 않으면서 PCR 민감도를 향상시킵니다.

   - 표본 수집 절차

   모든 수집은 표준화된 공복 조건(아 쥔) 하에서 수행됩니다: 참가자는 수집 최소 8시간 전(밤새 교정장치 착용)에 먹기, 마시기(물 허용), 양치질, 구강 세정제 사용 및 교정장치 제거를 삼갑니다.
   수집은 아침에 이루어집니다.
   각 방문 시, 치은상 플라크는 멸균 큐렛으로 열구로 들어가지 않고 각 지표 치아에서 부드럽게 제거되며, 해당 부위는 솜 롤로 격리됩니다.
   세 개의 멸균 페이퍼 포인트(크기 #25, Sacace PeriodontScreen Real-TM 키트에 명시된 대로)가 치열궁당 세 개의 지표 부위에 순차적으로 삽입되며, 각각 10-20초 동안 제자리에 고정됩니다.
   동일한 치열궁의 세 개 페이퍼 포인트는 즉시 단일 Eppendorf 튜브(200 ul 멸균 PBS)로 풀링되어, 시간 지점별 치열궁당 하나의 생물학적 표본을 생성합니다.

   - 지표 부위 선택(사전 지정, T0에서 기록, T1 및 T2에서 변경 없음): 1차 규칙: 각 치열궁 내에서 가장 큰 탐침 깊이를 가진 세 부위가 해부학적 영역(전치부, 소구치부, 구치부)에 관계없이 지표 부위로 선택됩니다.
   세 부위 모두 가장 깊은 경우 동일한 영역에 있을 수 있습니다.
   동점 처리 - 상악궁(두 개 이상의 부위가 가장 큰 탐침 깊이를 공유하고 세 개 미만의 고유한 가장 깊은 부위를 구별할 수 있을 때): 1.6번 치아 근심 + 2.6번 치아 근심 + 1.1번 치아 중앙.
   이 선택은 우측 상악 제1대구치와 우측 상악 중절치에서 치은하 표본을 수집한 Lombardo 등(2021)이 사용한 상악 채취 부위와 일치합니다.
   동점 처리 - 하악궁: 4.6번 치아 근심 + 3.6번 치아 근심 + 4.1번 치아 중앙.
   이 규칙은 연구자가 사전에 상악 동점 처리의 해부학적 대칭(대구치-대구치-절치)으로 정의하며, 해당 위치에서 동일한 치아 유형을 사용하여 하악궁에 적용합니다.
   교정 환자의 치은하 미생물군에 대해 동일한 하악 동점 처리 규칙을 사용한 발표된 연구는 확인되지 않았습니다; 따라서 이 규칙은 연구자 정의 프로토콜 결정으로 여기에 사전 지정 및 문서화됩니다.
   동일한 세 개의 지표 부위가 T1과 T2에서 치열궁당 사용됩니다.

   - 순응도 모니터링 및 중도탈락 프로토콜

   교정장치 착용 순응도(목표 22시간/일 이상)는 각 연구 방문 시 자가 보고로 평가됩니다.
   두 번 이상의 연속 방문에서 22시간/일 미만의 순응도를 보고한 참가자는 연구에서 제외되며, 그 데이터는 프로토콜 준수 분석에서 제외됩니다.
   비순응도가 보고된 단일 방문은 구두 강화를 유발하며 프로토콜 이탈로 기록됩니다.
   모든 등록 참가자는 순응 상태에 관계없이 의도치 치료 설명에 포함됩니다.
   T0: 여섯 개의 페이퍼 포인트(치열궁당 세 개)가 모두 하나의 Eppendorf 튜브(200 ul 멸균 PBS)로 풀링됩니다 - 기초 시 참가자당 총 하나의 튜브.
   T1 및 T2: 치열궁당 세 개의 페이퍼 포인트가 치열궁별(치은상 설계 치열궁 및 치은연 접촉형 설계 치열궁)로 별도의 Eppendorf 튜브로 풀링되며, 참가자 코드, 시간 지점 및 치열궁 지정으로 라벨링됩니다 - 시간 지점별 참가자당 두 개의 튜브.
   튜브는 Aorys Clinic, Sibiu에서 2-4시간 내에 -20도 C로 냉동됩니다.
   표본은 단열 용기에 냉동 젤 팩과 함께(운송 약 2-2.5시간) Microbiology Department, UMFST Targu Mures로 배치 운송됩니다.
   분석 전 -20도 C 저장은 치은하 세균 DNA 보존을 위한 검증된 프로토콜과 일치합니다.

   - 실험실 분석

   표본은 George Emil Palade University of Medicine, Pharmacy, Science, and Technology of Targu Mures 및 Mures County Clinical Hospital의 Microbiology Department에서 PeriodontScreen Real-TM 키트(Sacace Biotechnologies Srl, Via Scalabrini 44, 22100 Como, Italy; REF T01707-96-S; CE 표시 IVD)를 사용하여 분석됩니다.
   DNA 추출: 페이퍼 포인트는 PBS에서 세균을 용출하기 위해 혼합합니다(30초).
   현탁액을 원심분리(12,000 x g, 2-3분), 상층액 제거, 및 세균 DNA를 펠릿에서 상업적 추출 키트(QIAamp DNA Mini Kit, Qiagen 또는 동등한 검증된 키트)를 사용하여 제조업체 지침에 따라 추출합니다.
   실시간 PCR: PeriodontScreen Real-TM 분석은 특정 형광 프로브(FAM 채널, 40 사이클; HEX 채널 내부 대조군)를 사용하여 일곱 가지 치주 병원체 종을 검출 및 정량합니다.
   키트 검증된 임상적 유의성 임계값: A. actinomycetemcomitans 10^4 복사본/반응 이상; P. gingivalis, T. forsythia, T. denticola 10^5 이상; P. endodontalis, F. nucleatum, P. intermedia 10^6 이상.
   결과는 FAM Ct가 35 미만일 때 주어진 병원체에 대해 양성입니다.
   결과는 FAM Ct가 35 미만일 때(HEX Ct 값에 관계없이), 또는 HEX Ct가 35 미만일 때 유효한 것으로 간주됩니다.
   결과는 FAM Ct와 HEX Ct 모두 35를 초과하거나 없을 때 무효로 간주되며 반복해야 하며, 이는 추출 실패 또는 PCR 억제 가능성을 나타냅니다.
   실험실 인원은 어느 치열궁이 어느 트리밍 라인 설계에 해당하는지 모르는 상태로 코드화된 튜브(참가자 코드, 치열궁, 시간 지점)를 받습니다.
   추가적으로, 표본 수집자(일반 치과 전문의 및 교정 전공의, 치료 임상의와 분리됨)는 모든 시간 지점에서 치열궁 할당에 대해 완전히 눈가림됩니다: 수집자는 어느 트리밍 라인 설계가 각 치열궁에 할당되었는지 모르는 상태로 모든 치은하 채취를 수행합니다.
   치료 임상의(PI)는 모든 PCR 분석이 완료된 후에만 공개되는 할당 키를 보유합니다.

   - 통계 분석

   확증적 1차 분석: 확증적 종점은 T2(8주)에서의 치열궁 수준 병원체 부담 점수(0-7)입니다.
   단일 Wilcoxon 부호 순위 검정(짝지음, 양측, 알파 = 0.05)이 T2에서 치은상 대 치은연 접촉형 치열궁 점수를 비교할 것입니다.
   이 검정은 결과가 짝지음 분할구 설계에서 이산 순서형 계수(정수 0-7)이므로, 비모수 짝지음 비교가 적절하며 분포 가정이 필요하지 않기 때문에 선택되었습니다.
   T2에서의 단일 확증적 검정은 다중성에 대한 수정 없이 제1종 오류율을 알파 = 0.05로 통제하기 위해 사전 지정됩니다.

   - T1에서의 지원적 분석: Wilcoxon 부호 순위 검정은 또한 T1(4주)에서 지원적, 비확증적 분석으로 적용되어 관찰된 효과의 시간적 패턴을 특성화할 것입니다.
   T1 결과는 기술적으로 보고될 것이며; T1 검정에서 확증적 추론은 도출되지 않을 것입니다.

   조정 분석: Generalized Estimating Equations(GEE) 모델이 T1과 T2에서 치열궁 수준 병원체 부담 점수에 적합될 것이며, 다음과 같이 지정됩니다: (1) 반응: 치열궁 수준 병원체 부담 점수(0-7); (2) 연결 함수: 항등; (3) 분포군: 가우시안; (4) 작업 상관 구조: 교환 가능, 시간에 걸쳐 동일한 대상 내 상관이 가정된 두 개의 기초 후 시간 지점에 적합; (5) 공변량: 트리밍 라인 설계(이항: 치은상 대 치은연 접촉형), 시간 지점(범주형: T1, T2), 치열궁당 계획된 함입 정도(연속, mm).
   설계 x 시간 지점 상호작용 항은 트리밍 라인 설계의 효과가 T1과 T2 사이에서 다른지 평가하기 위해 검정될 것입니다; 상호작용 항이 통계적으로 유의하지 않으면(p > 0.10), 제거되고 주효과만 있는 모델이 보고될 것입니다.
   GEE 모델은 시간 지점에 걸친 대상 내 상관을 설명하며 사전 지정된 비무작위 할당 변수(계획된 함입 정도)를 조정합니다.
   GEE 분석은 R(버전 4.0 이상)의 geepack 패키지를 사용하여 수행될 것입니다.

   • 탐색적 분석: McNemar 검정으로 T1과 T2에서 두 설계 간 치열궁 수준 red complex 양성률(이항 결과)을 비교합니다.
     기술적으로만 해석되며; 확증적 추론은 도출되지 않을 것입니다.
     이 탐색적 결과에 대한 예상 검정력은 약 22%이며, 이는 치주 건강한 참가자에서 동시 red complex 양성률의 낮은 예상 유병률 때문입니다.
     이 낮은 검정력은 인정되며 결과는 이에 따라 탐색적으로 등록됩니다.
   • 결측 데이터: 결측 결과 데이터는 완전사례 분석으로 처리됩니다.
     T1과 T2 모두에서 평가 가능한 데이터를 가진 참가자가 확증적 분석에 사용되는 프로토콜 준수 모집단을 구성할 것입니다.
     T0 이후 중도탈락한 참가자를 포함한 모든 등록 참가자는 의도치 치료 모집단에서 기술될 것입니다; 예상 중도탈락률이 10% 이하이므로 1차 분석에 대해 대체는 수행되지 않을 것입니다.
   • 소프트웨어: 주요 확증적 분석(Wilcoxon 부호 순위 검정) 및 기술 통계는 GraphPad Prism 8(버전 8.0.2)을 사용하여 수행될 것입니다.
     GEE 모델은 R(버전 4.0 이상)에서 수행될 것입니다.
     모든 보고된 p-값은 양측입니다.
     중간 분석은 계획되지 않았습니다.
   • 표본 크기 정당화

   표본 크기는 짝지음 대상 내(분할구) 설계에 대해 몬테카를로 시뮬레이션(10,000회 반복)으로 결정되었습니다.
   시뮬레이션 매개변수는 트리밍 라인 설계 효과에 대한 치은하 병원체 부담에 관한 발표된 파일럿 데이터가 없는 상태에서 보수적으로 선택되었습니다:

(1) 치열궁 간 최소 임상적 의미 차이: 임계값 이상 0.5종, 이는 치은연 접촉형 치열궁에 비해 치은상 치열궁에서 임상적 유의성 임계값을 초과하는 하나의 추가 병원체 종을 나타냅니다; (2) 개별 치열궁 수준 점수의 표준 편차(시그마): 0.88, 이는 짝지음 차이의 표준 편차(시그마_D)가 0.964임을 의미합니다[시그마_D = 시그마 x sqrt(2 x (1 - 로)) = 0.88 x sqrt(1.2) = 0.964]; 이는 파일럿 데이터 없이 참가자 간 변이성에 대한 보수적 추정치를 나타냅니다; 짝지음 차이는 대략 대칭(정규 마진을 가진 가우시안 코플라)으로 시뮬레이션되었으며, 이는 Wilcoxon 검정력 추정을 위한 보수적 기준입니다; (3) 대상 내 상관 로 = 0.4, 분할구 치주 미생물학 연구에 보고된 값과 일치; (4) 양측 알파 = 0.05; (5) Wilcoxon 부호 순위 검정.

시뮬레이션은 추정 검정력 = 82.7%(1차) 및 82.3%(독립 검증), 경험적 제1종 오류 = 5.0%, n = 35명 평가 가능 참가자에서 산출되었습니다.
약 10%의 예상 중도탈락률(추적 손실, 22시간/일 교정장치 착용 비순응, 프로토콜 이탈)을 고려하여, 39명 참가자의 등록 목표가 설정되었습니다.

- 제한 사항

PeriodontScreen Real-TM 키트는 활동성 치주 질환 인구에 대해 검증되었습니다; 그 임상적 유의성 임계값은 등록 참가자의 건강한 치주 상태에 대해 완전히 보정되지 않았을 수 있습니다.
결과는 이에 따라 해석될 것입니다.

비무작위 할당 규칙은 계획된 함입 정도 이상의 치열궁 수준 생역학적 교란 가능성(예: 토크 교정, 횡적 이동)을 도입하며, 이는 GEE 공변량으로 완전히 포착되지 않습니다.
치열궁당 계획된 함입 정도는 GEE 모델에서 연속 공변량으로 기록 및 조정됩니다; 다른 이동 유형으로부터의 잔여 생역학적 교란은 배제될 수 없습니다.

T0 표본이 양측 풀링된 샘플을 나타내기 때문에, 치열궁 특이적 기초 병원체 점수는 이용할 수 없습니다.
따라서 1차 분석은 개별 치열궁 수준 기초 값에 대한 조정 없이 T1과 T2에서 치열궁 특이적 점수를 직접 비교합니다.
이 제한은 기초 시 임상적으로 건강한 치주 상태(탐침 깊이 3mm 이하, 지표 부위에서 탐침 시 출혈 없음)의 포함 기준으로 완화되며, 이는 중재 전 기존 치열궁 수준 미생물학적 비대칭 가능성을 최소화합니다.